LUCAT1 在胃癌組織中的表達及對胃癌細胞增殖侵襲的影響*

孫永新，韋 笑，曹 維

（南通大學附屬醫(yī)院消化內科，江蘇 226001）

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,在癌癥相關死亡中位居第四[1]。2016 年我國新診斷癌癥4 064 000例,其中胃癌396 500 例,占9.8%,位居第三[2]。由于胃癌早期缺乏典型臨床表現,多數患者確診時已是晚期,預后較差。因此,發(fā)現有效的生物學標記對胃癌的早期診斷和治療具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是指長度超過200 個堿基對而無蛋白編碼功能的RNA,在人類細胞中廣泛表達,在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。肺癌相關轉錄本1（LUCAT1）作為一種LncRNA,在多種腫瘤組織中異常表達,且與腫瘤細胞的增殖和侵襲關系密切。本研究選取我院2015—2020 年手術切除的胃癌組織及配對癌旁正常組織18 例以及人胃癌細胞株,檢測LUCAT1 的表達,探討LUCAT1 對胃癌細胞增殖和侵襲的影響,旨在進一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,為尋找胃癌治療靶點提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 術后經病理證實的胃癌患者18例,其中男性10 例,女性8 例,年齡38～85 歲,平均56±5 歲。手術切取的胃癌組織及其配對癌旁正常組織標本置于液氮中保存待檢。所有患者術前均未接受放療、化療及腫瘤輔助治療。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 檢測胃癌及癌旁組織中LUCAT1表達:TRIzol 法提取組織樣本總RNA,采用Thermo Fisher 公司SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System 合成cDNA 第一鏈。使用Primer 5.0 軟件設計PCR 引物,由上海Invitrogen 公司合成。引物序列:LUCAT1 F:5’-GTGTCAAGCTCGGATTGCCT-3’,R:5’-GAGCCCACACACTCAGGTTC-3’;GAPDH F:5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’;R:5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’。以GAPDH 為內參,采用2-ΔΔCt計算LUCAT1 相對表達水平。采用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix 試劑盒,Light Cycler 96 PCR 儀檢測LUCAT1 表達。PCR 擴增體系:SYBR Premix12.5 μL,Prime F 和R（10 μmol/L）各1 μL,cDNA 2 份,每份2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應條件:預變性95 ℃30 s,PCR 反應95 ℃5 s,60 ℃30 s,共40 個循環(huán)。

1.2.2 細胞培養(yǎng):將4 種人胃癌細胞株（BGC-823,AGS,SGC7901,MKN45）培養(yǎng)于含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液中,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),當細胞融合度達到70%～80%時進行傳代。采用TRIzol 法提取細胞總RNA,參照1.2.1 中RT-qPCR實驗步驟檢測不同胃癌細胞株中LUCAT1 的表達,選擇LUCAT1 高表達的SGC7901 細胞株進行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR 法檢測各組SGC7901 細胞LUCAT1表達:將SGC7901 細胞分為si-NC 組、si-LUCAT1組、pLV-NC 和pLV-LUCAT1 組,根據LipofectamineTM3000 轉染試劑說明書,分別轉染陰性對照siRNA、LUCAT1、siRNA 空載體質粒及過表達質粒pLV-LUCAT1,轉染后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。利用RT-qPCR 檢測各組細胞LUCAT1的表達水平以驗證轉染效果。LUCAT1 引物序列:上游:5’-CUCAGUGUCACACAUUUCATT-3’,下游:5’-UGAAAUGUGUGACACUGAGTT-3’。

1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖:吸取各組SGC7901 細胞懸液100 μL（含2 000 個細胞）,置于96 孔板中培養(yǎng)72 h,每孔加入100 μL MTT 溶液（5 mg/mL）,在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液,繼續(xù)孵育直至顯微鏡觀察發(fā)現Formazan 全部溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀,選擇570 nm波長測定吸光度,繪制細胞活性曲線,實驗設3復孔。

1.2.5 Transwell 細胞遷移實驗:采用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基按1:8 比例稀釋基質膠,包被在Transwell 小室底部膜的上室面,37 ℃放置2 h 使基質膠充分包被。取各組SGC7901 細胞懸液撤血清饑餓12～24 h,以進一步去除血清影響。消化后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞,調整細胞濃度為1×106/mL。用溫暖的無血清培養(yǎng)基輕洗形成膠狀的基質膠,取100 μL細胞懸液加入上室,600 μL 含20%FBS 培養(yǎng)基加入下室,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣PBS洗2 遍,甲醇固定30 min,將小室適當風干。室溫下Gimusa 染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未侵襲細胞,用PBS 洗3 遍。200 倍顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察細胞,記數并進行統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析處理,GraphPad 8.0 軟件繪圖。符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中LUCAT1 表達 RT-qPCR 檢測結果顯示,胃癌組織中LUCAT1 表達水平顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 胃癌組織和癌旁正常組織中LUCAT1 表達

2.2 胃癌細胞中LUCAT1 表達 LUCAT1 在BGC-823、AGS、SGC7901 及MKN45 胃癌細胞株中均有表達,SGC7901 細胞LUCAT1 表達量顯著高于其他細胞株,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,選擇SGC7901 細胞進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖2 胃癌細胞中LUCAT1 表達

2.3 各組SGC7901 細胞LUCAT1 表達比較 RTqPCR 結果顯示,si-LUCAT1 組中LUCAT1 表達較si-NC 組降低,而pLV-LUCAT1 組中LUCAT1 表達較pLV-NC 組增加,差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）,提示質粒轉染成功。見圖3。

圖3 各組SGC7901 細胞中LUCAT1 表達

2.4 各組SGC7901 細胞增殖水平比較 MTT 檢測結果顯示,si-LUCAT1 組細胞增殖水平顯著低于si-NC 組,pLV-LUCAT1 組細胞增殖水平顯著高于pLV-NC 組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組SGC7901 細胞增殖曲線

2.5 各組SGC7901 細胞侵襲能力比較 Transwell實驗顯示,si-LUCAT1 組細胞的侵襲能力顯著低于si-NC 組（P＜0.05）,pLV-LUCAT1 組細胞的侵襲能力顯著高于pLV-NC 組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲

3 討論

LncRNA 與DNA、RNA 和轉錄因子相互作用調控DNA 甲基化、組蛋白修飾及染色質重塑等多種生物學過程,在表觀遺傳、細胞周期和細胞分化調控等生理過程中發(fā)揮重要作用。目前在多種人類腫瘤中發(fā)現lncRNA 表達量的改變,如在腎癌細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR 主要通過影響特定基因位點H3K27 甲基化而調控基因表達,最終促進腫瘤細胞增殖,抑制細胞凋亡[3];在非小細胞肺癌中l(wèi)ncRNA LUCAT1 通過海綿化miR-493-5p 來調節(jié)RAC1 的表達,從而影響非小細胞肺癌的生長、遷移、侵襲和預后[4]。有研究證實,LncRNA AK023391 可通過激活PI3K/Akt信號通路促進胃癌的發(fā)生和侵襲[5]。

肺癌相關轉錄本LUCAT1 位于5 號染色體14.3區(qū),因其通過表觀遺傳抑制P21 和P57 表達促進非小細胞肺癌細胞增殖而得名[6]。據報道,LUCAT1 通過調節(jié)miR-199a-5p 表達促進卵巢癌細胞增殖[7]。近年來,有文獻表明LUCAT1 在胃癌中表現惡性生物學行為,LUCAT1 表達水平與胃癌患者的分期和預后相關[8]。本研究結果顯示,胃癌組織中LUCAT1表達顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;LUCAT1 過表達胃癌細胞增殖和侵襲能力增強,抑制LUCAT1 表達后胃癌細胞增殖和侵襲能力下降,提示LUCAT1 促進胃癌細胞的增殖和侵襲能力,在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,有望成為胃癌診斷和治療的生物學指標。