PRKN 基因突變所致早發型帕金森病家系的臨床特征及基因檢測

廖書勝 ，陳 紅 ，劉 玫 ，潘成玉 ，羅璦滌 ，張 麗

（1）廣西醫科大學附屬柳州市人民醫院神經內科，廣西 柳州 545006;2）遵義醫科大學附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563003）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經系統退行性疾病，國外報道60 歲以上人群患病率大約1%，85 歲以上人群患病率大約4%～5%[1?2]。在我國65 歲以上人群的患病率為1700/10 萬，并隨年齡增長而升高。其中，早發型PD（early-onset Parkinson’s disease，EOPD）（45歲前發病）約占所有PD 病例的3.6 %。PD 的發病是因各種原因導致多巴胺能神經元的進行性變性丟失而所致，臨床以肌強直、運動遲緩、靜止性震顫和姿勢不穩等運動癥狀及非運動癥狀為特征。帕金森病的發病機制目前尚不明確，可能與遺傳因素、環境因素及衰老有關[3?5]。

研究發現[5?6]，在大約3%的帕金森綜合征患者中可檢測到遺傳變異，而在EOPD 和常見帕金森病患者中，這一比例可高達77 %。最近的研究已確定了20 余個PD（尤其是EOPD 病）相關的致病基因，如PRKN（PARK2）、PINK1（PARK6）、DJ-1（PARK7）、LRRK2（PARK8）等[7?8]。其中，由PRKN基因突變所致的PARK2 約占家族性常染色體隱性EOPD 病的50%[9?10]。

PRKN基因包含12 個外顯子，跨度1.3 Mb，編碼蛋白含465 個氨基酸殘基，具有泛素結合酶（E2s）Ubch7 或Ubch8 的特征結構域[11]。迄今為止，已報道了400 多種已知的PRKN基因突變形式，包括點突變、小插入/缺失、外顯子缺失、剪接位點突變和外顯子重排等。由PRKN基因突變所致的PD 患者臨床表現相對不典型，具有發病早、進展慢，對左旋多巴治療反應良好等特征，與散發性PD 相比，臨床易出現肌張力障礙等其他運動障礙癥狀[12]。因此，早期基因篩查和基因型-表型相關分析對這類患者的診斷和發病機制的研究具有重要意義。對于由PRKN突變引起的常染色體隱性青少年帕金森病，已經在體外進行了一些基因治療的相關研究，有望在臨床治療中用于帕金森病的治療[13]。本研究通過對2 個AREP 家系的臨床資料分析，并應用下一代測序和MLPA 方法進行基因突變檢測，希望能進一步促進對AREP 的臨床表現及基因突變形式的認識與了解。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究中共納入2 個家系中的2 名EOPD 患者及3 名正常成員。詳細收集患者的臨床表現、病史、體格檢查、實驗室檢查和基因檢測結果。根據受試者的臨床表現和體格檢查，2 名患者符合2016 年版《中國帕金森病的診斷標準》的診斷標準[14]，診斷為臨床確診PD，而其他家庭成員無PD 的臨床表現。實驗室檢查包括甲狀腺功能檢查和血清銅藍蛋白檢查。臨床評估按照2016 年版《早發型帕金森病的診斷與治療中國專家共識》[15]用MDS-統一帕金森病評定量表（MDSUPDRS）、Hoehn 和Yahr 量表（H&Y）和帕金森病問卷-39（PDQ-39）進行。采用簡易精神狀態檢查（MMSE）評估認知功能。應用HAMD 和HAMA 測試患者是否存在情緒障礙。實驗室檢查包括血常規、肝腎功能、甲狀腺功能檢查和血清銅藍蛋白檢查等。應用3.0 T 磁共振成像的對患者進行了腦結構成像評估。外周血基因組DNA 的提取按照試劑盒說明書操作步驟進行。

本研究為回顧性病例報道，通過遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會審批[批準號：KLL-2022-691]。納入本研究的患者及其家庭成員均被告知本研究的目的，并獲得了知情的書面同意。

1.2 基因檢測

用EDTA 抗凝管抽取2 名患者及家系一中的父母、姐姐共5 名受試者2 mL 靜脈血。血樣送至北京康旭醫學檢驗中心，使用DNA 血液微型試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）提取DNA，建立全基因組文庫。對先證者樣品利用探針捕獲富集目標序列和二代測序的方法檢測141 個已知的與PD、震顫、肌張力障礙和其他運動障礙相關的基因；應用多重連接依賴探針擴增（MLPA）法檢測SNCA、LRRK2、PARK2、PINK1、PARK7、ATP13A2、UCHL1、GCH1等基因外顯子的重排和大缺失突變，根據荷蘭MRC Holland company 提供的標準方案，使用SALSA MLPA probe mix 試劑盒進行缺失分析。檢測到突變后設計特定引物利用Sanger測序或MLPA 法進一步證實并進行家系分析。查詢HGMDpro 數據庫的報道情況并參考ACMG 指南對突變的致病性進行評級。對于內含子變異進一步運用罕見病數據庫中心在線生物信息學預測工具（rddc.tsinghua-gd.org/search-middle?to=Patho-PredicModel）進行剪接型分析預測。

2 結果

2.1 臨床特點

本研究共調查了2 家系共2 名患者。表1 匯總了2 名患者的詳細臨床特征和量表評估。家系2 患者除存在PRKN 基因突變（3～4 號外顯子純合缺失變異）外，還存在LRRK2基因c.4827+6T>A雜合變異及PINK1 基因c.1474C>T/p.Arg492* 雜合變異。2 名患者的臨床表現顯示出一些相似性，例如早發、進展緩慢，對小劑量左旋多巴反應良好。但這2 例患者的表型也存在一定差異。首先是首發癥狀不同：家系1 患者以右上肢靜止性震顫起病，家系2 患者表現為僵硬和運動遲緩起病。其次是：家系2 患者病程早期出現下肢肌張力障礙和姿勢不穩，家系1 的患者整個病程中未出現類似癥狀；家系2 患者的自主神經功能障礙癥狀多且更為明顯，相比而言，家系1 的患者自主神經功能癥狀不明顯。最后，家系2 患者的生活質量較家系1 的患者差，PDQ-39 評分為18 分，家系2 患者的UPDRS-III、HAMD 評分均較高（表1）。2 名患者的血常規、肝功能、腎功能、甲狀腺功能、血清銅藍蛋白等血液檢查均正常。

2.2 基因檢測結果

基因檢測結果發現家系1 的患者（圖1A，II-2）存在PRKN基因2 號外顯子雜合缺失變異和c.619G>T/p.Glu207Ter*雜合變異2 種突變（圖1B，C），患者的父親及姐姐攜帶c.619G>T/p.Glu207Ter*雜合變異（圖1D，E），不攜帶PRKN基因2 號外顯子雜合缺失（圖1F，G）；患者的母親攜帶PRKN基因2 號外顯子雜合缺失（圖1H），而不攜帶c.619G>T/p.Glu207Ter*變異（圖1I），提示該復合雜合變異與疾病存在家系共分離。家系2 只采集有患者的血樣品，發現患者（圖2A，II-2）存在PRKN基因3～4 號外顯子純合缺失變異（圖2B），另外發現患者存在LRRK2基因c.4827+6T>A 雜合變異（圖2C）及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492*雜合無義變異（圖2D）；生物信息學分析發現LRRK2基因的c.4827+6T>A 變異可能導致剪切改變，插入332 bp 堿基造成移碼提前終止翻譯成截短蛋白（圖3）。2 名患者未檢測到與PD、震顫、肌張力異常和其他運動障礙相關的一些基因的其他突變。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會指南的相關內容，PRKN基因的2 號外顯子缺失、3～4 號外顯子缺失、c.619G>T/p.Glu207Ter*變異，LRRK2基因的c.4827+6T>A 變異及PINK1基因的c.1474C>T/p.Arg492* 變異均被評級為致病變異，文獻復習發現這些突變在國內外人群中有雜合形式的報道，但家系1 患者的PRKN基因復合雜合突變形式及家系2 患者同時攜帶3 個PD 致病基因突變的突變形式均未見報道。

圖1 家系1 的系譜圖及基因測序圖Fig.1 Pedigree and gene sequencing of family 1

圖2 家系2 的系譜圖及基因測序圖Fig.2 Pedigree and gene sequencing of family 2

圖3 LRRK2 基因c.4827+6T>A 變異的剪接預測（https://rddc.tsinghua-gd.org/tools/patho-predic/result?uuid=005c2fe7-8ebf-4489-a3b0-802b42aeabfb）Fig.3 Splicing prediction of LRRK2 gene c.4827+6T>A mutation

3 討論

PRKN基因（NM_004562.2）定位于染色體6q25.2q27，其突變導致編碼的parkin 蛋白功能喪失在常染色體隱性遺傳青少年帕金森綜合征（ARJP）的發病機制中起重要作用。Kitada[16]于1998年首次報道了導致常染色體隱性帕金森綜合征的PRKN基因的缺失突變。隨后，發現了該基因的多種突變，包括錯義突變、無義突變、截段、缺失、重復和移碼。目前已經報道了400 多種已知的PRKN基因變異。這些突變可以以純合、雜合和復合雜合狀態存在，外顯子重排，包括缺失和重復，占致病變異的50%以上，比點突變或小的插入/缺失更有可能是致病變異，導致癥狀更早出現。

在這項研究中，筆者篩選了2 個患者中141個先前報道的與帕金森病、震顫、肌張力障礙和其他運動障礙相關的基因的點突變和缺失突變，在家系1 的先證者中發現了PRKN基因的無義突變與2 號外顯子缺失突變的新的復合雜合突變，家系共分離分析提示這2 種變異分別來自父母親，與疾病存在共分離。這些證實了新的復合雜合突變的PRKN基因是此EOPD 家庭的致病突變。家系2 的先證者存在的PRKN基因3～4 號外顯子純合缺失變異，推測可能來自于父母親，是一已知突變形式。與其他報道的攜帶此類突變的患者相比，本研究家系2 的患者臨床發病年齡更早，癥狀更重，病情進展更快?？赡芘c該患者存在LRRK2基因c.4827+6T>A 雜合變異及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 雜合無義變異有關。筆者運用生物信息學分析發現LRRK2 基因的c.4827+6T>A 變異可能導致其剪切改變（圖3）。

由PRKN基因編碼的parkin 蛋白由465 個氨基酸組成，包括N 端的一個Ub 樣（Ubl）結構域和4 個環樣結構域。作為E3 泛素（Ub）連接酶，parkin 與E1（Ub 激活）和E2（Ub 結合）共同參與蛋白酶體降解蛋白異常積累的泛素化。parkin 功能障礙會損害線粒體的生物合成，導致線粒體功能降低，而受損線粒體的積累導致多巴胺能神經元變性[17]，Parkin 可與PINK1 及LRRK2 蛋白相互作用，在線粒體自噬及囊泡運輸等細胞功能起重要作用，一種蛋白的功能障礙會影響與其互作的蛋白質功能[18]。本研究家系2 的患者比其他報道的攜帶此類突變的患者的臨床發病年齡更早，癥狀更重，病情進展更快，推測可能是因為同時存在Parkin、PINK1 及LRRK2 突變，對細胞功能影響更大有關。這有待于進一步的蛋白質功能研究。

本研究的主要局限是樣本量小。因此，表型分析的結果可能會有一定的偏差，需要進行更大樣本量的進一步研究或多中心研究來驗證報告的發現。其次，研究突變的蛋白質功能改變是從預測軟件中獲得的。雖然預測軟件可以幫助筆者了解這些變異的功能，但最終需要具體的功能研究來驗證它們在PRKN基因相關PD 中的作用。本研究首次報道了1 個EOPD 家系存在PRKN基因2 號外顯子缺失變異和c.619G>T/p.Glu207Ter*變異的復合雜合變異。在另外1 個EOPD 家系首次發現了PRKN基因3～4 號外顯子純合缺失合并LRRK2基因c.4827+6T>A 雜合變異及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 雜合變異。然而，這項研究有一些局限性，筆者在一個家系中無法從先證者的父親、母親及其他家庭成員那里采集血樣。后續將繼續隨訪這個家庭的所有成員。

綜上，筆者在2 例EOPD 病患者中發現了PRKN基因新的復合雜合變異。比較2 例患者的臨床癥狀還發現，存在PRKN基因突變合并PD其他致病基因變異患者的臨床發病年齡更早，癥狀更重更復雜，病情進展更快。提示EOPD患者具有典型的臨床異質性及遺傳異質性。