Th17 和Treg 細胞與慢性光化性皮炎的相關性

楊成林 ，胡 婕 ，王 靜 ，王敏華 ，黃 玲

（1）大理護理職業學院內科教研組，云南 大理 671000;2）六安市中醫院皮膚科，安徽 六安 237000;3）復旦大學附屬金山醫院皮膚科，上海 200540;4）大理大學第一附屬醫院皮膚科，云南 大理 671001）

慢性光化性皮炎（chronic actinic dermatitis，CAD）是一種慢性的、能持續影響曝光部位皮膚的光誘導性皮炎，50～70 歲的老年男性為好發人群，皮損反復發作可以持續數年乃至更久，這就給CAD 的患者帶來了極大的痛苦，其病因及發病機制較為復雜，既往研究認為，T 細胞亞群與CAD 的發生、發展有密切關系[1]。CAD 患者中也可能存在輔助性T 淋巴細胞17（Th17 cells）和調節性T 淋巴細胞（Treg cells）細胞的失衡，筆者對CAD 患者的Th17 細胞與Treg 細胞的實驗室指標作相關性分析，以期為揭示CAD 的發病機制提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集大理大學第一附屬醫院皮膚科2017 年1月至2018 年12 月收治并確診的CAD 患者25 例，符合Norris 和Hawk 診斷標準[2]。同時隨機選取20 名至大理大學第一附屬醫院體檢的健康志愿者作為對照組，對照組與CAD 患者的性別年齡等一般資料，差別無統計學意義，具有可比性（P>0.05）。CAD 患者排除標準[3]：（1）有其他光敏性皮膚病的患者；（2）對測試的變應原過敏者；（3）有機體抵抗力低下，嚴重器質性疾病的患者（肝功能衰竭、急慢性腎功能損傷、心肺功能不全、活動性肺結核、甲亢等）；（4）孕婦和哺乳期婦女；（5）測試區有局部感染者；（6）試驗之前停用糖皮質激素類藥物未達1 周及停用免疫抑制劑未達2 周，停用抗組胺藥未達（2～3）d 者。排除標準：（1）測試者擁有CAD 診斷標準中的任意一項；（2）近3 月來有疾病發生；（3）近期使用過糖皮質激素和/或免疫抑制劑。本研究獲得醫院倫理委員會批準，入選病例均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

流式細胞術檢測25 例CAD 患者及20 名健康志愿者外周血CD4+T 淋巴細胞中Th17 細胞/Tregd 的比值，同時應用免疫組織化學法檢測25例CAD 患者和10 例健康對照組（因前述健康對照組中有10 例志愿者不同意進行皮膚活檢，故選取另外10 例）皮膚組織皮損白介素-17（IL-17）；叉頭轉錄因子p3（Foxp3）的表達。

1.2.1 流式細胞儀檢測Th17 細胞與Treg 細胞百分比人類Treg/Th17 試劑盒及同型對照抗體購自BD 公司。空腹采集5 mL EDTA 抗凝外周血將50 μL EDTA 抗凝外周血加入離心管封口，40 ℃低溫孵育15 min；按Treg/Th17 試劑盒說明依次加入抗體充分混勻后，孵育30 min，進行表面標記；加入紅細胞裂解液 2 mL，4 ℃避光孵育10 min，1200 r/min 離心5 min，棄上清；加入流式染色緩沖液，1200 r/min 離心5 min，離心棄上清；重復上述操作1 次，使離心管底部顏色接近透明或呈淡黃色；加入0.5 mL 流式染色緩沖液重懸固定，4 ℃保存，2 h 內上機檢測。使用美國BD 公司流式細胞儀[FACS Canto ⅡPlus（3 激光10 色）]進行檢測，上樣檢測后用Flowjo 軟件進行分析，自動獲得Treg 細胞和Th17 細胞在外周血CD4+T 中的百分率。Treg 細胞結果判讀是否為CD4+T 細胞中被標記為CD4+CD25+CD127 陰性或弱表達；Th17 檢測結果判讀為CD4+CD196+CD183-。

1.2.2 免疫組化法檢測IL-17 和Foxp3 的表達兔抗人foxp3 多克隆抗體及羊抗人IL-17 多克隆抗體均購于西格瑪奧德里奇貿易有限公司。將標本切片（4 μm 厚度）脫蠟、水化、烤片、沖洗后，3%H202去離子水孵育15 min，PBS 沖洗3×5 min，將切片置于EGTA 抗原修復液中修復。PBS 沖洗3×3 min，除去PBS 液，每張切片加非特異性染色阻斷劑1～2 滴，室溫下孵育15 min。傾去，每張切片上滴加1～2 滴的一抗試劑。其中鼠抗人IL-17 多克隆抗體（工作濃度為 1∶200）、兔抗人Foxp3 多克隆抗體（工作濃度為 1∶200）。切片在4 ℃冰箱過夜后在室溫下靜置30～60 min，PBS沖洗3×5 min。除去PBS 液，每張切片加酶標羊抗鼠或兔IgG 聚合物60 μL，室溫下孵育15 min。PBS 沖洗3×5 min。濾紙除去PBS 液，將DAB 顯色液滴加到切片上，每張切片滴加約60 μL，室溫下顯色2～3 min，鏡下觀察切片細胞的變化，當細胞中出現明顯棕色或棕黃色顆粒時及時將顯色液甩掉，

清水沖洗切片，使顯色反應終止。用肺鱗癌組織、小腸上皮組織作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照，HE 染色作組織學對照。以細胞質和（或）細胞核有棕黃色或深褐色顆粒為陽性。Foxp3 陽性定位于淋巴細胞中細胞核，胞核內出現棕黃色顆粒為陽性，IL-17 陽性定位于淋巴細胞中細胞漿，胞漿內出現棕黃色或褐色顆粒為陽性。光鏡下每張切片中選取淋巴細胞較多的5 個高倍視野。根據5 個視野中出現陽性細胞的個數來計算百分比：胞核或胞漿在顯微鏡下顯色呈棕黃色或棕褐色的細胞個數≥6%為陽性；<5%為陰性（-）。根據細胞著色深淺記分：未著色計0 分；淡黃色計1 分；棕黃色計2 分；棕褐色計3 分。以上2 種記分總得分除以2 為最終得分。0～0.5分為陰性（-）；1～3 分為陽性（+）。

1.2.3 CAD 患者皮損嚴重程度評分按Hanifin J M 等據PASI 評分修訂的EASI 評分表[4]對25 例CAD 患者皮損嚴重程度進行評分。

1.3 統計學處理

使用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計學分析，數據由均數±標準差（）表示，2 組間比較使用t檢驗，以α=0.05 為檢驗水準，P<0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAD 患者皮損嚴重程度評分

25 例慢性光化性皮炎患者EASI 評分為 6.8～33.95 分，平均（17.42±7.66）分。

2.2 Treg 細胞和Th17 細胞的流式細胞儀檢測結果

Th17 細胞原始散點圖分區明顯，CAD 患者Th17 細胞分布顯著高于對照組（圖1～2）；Treg細胞原始細胞散點圖細胞分區明顯，CAD 患者Treg 細胞顯著低于對照組（圖1～2）。與健康志愿者相比，CAD 患者Th17 細胞在外周血CD4+T 細胞中所占比例高于對照組，差異具有統計學意義（t=3.15，P<0.05）；CAD 患者Treg 細胞在外周血CD4+T 細胞中所占比例明顯少于對照組，差異具有統計學意義（t=7.414，P<0.01）；CAD 患者的Th 17/Treg 顯著高于對照組，差異具有統計學意義（t=8.930，P<0.01），見表1。

表1 各組Th17 細胞，Treg 細胞比例及Th17/Treg 比值（）Tab.1 Th17 cells，Treg cell ratio and Th17/Treg ratio in each group

表1 各組Th17 細胞，Treg 細胞比例及Th17/Treg 比值（）Tab.1 Th17 cells，Treg cell ratio and Th17/Treg ratio in each group

與健康對照組比較，*P <0.05，**P <0.01。

圖1 CAD 患者Treg 細胞和Th17 細胞的流式細胞儀檢測結果Fig.1 Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in CAD

圖2 健康對照組Treg 細胞和Th17 細胞的流式細胞儀檢測結果Fig.2 Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in healthy control group

2.3 CAD患者Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg 比值與EASI 評分相關性分析結果

Th17 細胞和Th17/Treg 的比值隨EASI 評分的增加而增加、Treg 細胞隨EASI 評分的增加而減少，可初步判斷Th17 細胞和EASI 評分之間、Treg 細胞和EASI 評分之間以及Th17/Treg 比值和EASI 評分之間有近似線性關系，進一步做Person直線相關分析：Th17 細胞和EASI 評分的相關系數r=0.985，P=0.000，差異具有統計學意義（P<0.05），提示2 者間存在正相關關系；Treg細胞和EASI 評分的相關系數r=-0.846，P=0.000，差異具有統計學意義（P<0.05），提示2 者間存在負相關關系；Th17/Treg 比值和EASI 評分的相關系數r=0.97，P=0.000，差異具有統計學意義（P<0.05），提示2 者間存在正相關關系，見圖3。

圖3 Th17 細胞、Treg 細胞和Th17/Treg 的比值與EASI 評分相關性分析Fig.3 Analysis of EASI score between the ratio of Th17 cells，Treg cells，and Th17/Treg

2.4 CAD 病例組與健康對照組免疫組織化學法檢測結果比較

Foxp3 陽性染色定位于細胞核，IL-17 陽性染色定位于胞漿，CAD 病例組Foxp3、IL-17 陽性細胞主要分布在真皮淺層淋巴細胞。健康對照組二者僅在部分標本的真皮淺層呈弱陽性表達。CAD 病例組與健康對照組間Foxp3 比較，差異無統計學意義（χ2=0.373，P>0.05）。CAD 病例組與健康對照組間IL-17 比較，差異有統計學意義（χ2=19.288，P<0.05）；見表2、表3、圖4（a，b，c，d），圖5（e，f，g，h）。

表2 Foxp3 在CAD 病例組與健康對照組皮膚中表達差異（n）Tab.2 The difference of Foxp3 expression in skin（n）

表3 IL-17 在CAD 病例組與健康對照組皮膚中表達差異（n）Tab.3 The difference of IL-17 expression in skin（n）

圖4 健康對照組皮膚組織的免疫組織化學Fig.4 Immunohistochemistry of skin tissue in healthy control group

圖5 CAD 皮膚組織的免疫組織化學Fig.5 Immunohistochemistry of skin tissue in CAD

3 討論

目前普遍認為CAD 的發病機制為光敏物質與皮膚結合形成的新抗原誘導的DTH。DTH 主要由T 淋巴細胞介導，而T 淋巴細胞可分為CD4+和CD8+2 大亞群，Treg 及Th17 細胞均是CD4+T 細胞的一個亞群。陳浩、鄧丹琪等[5]用免疫組化的方式發現，CAD 患者皮損內存在有Th 細胞和Tc細胞，在早期主要以CD4+T 細胞介導的DTH 為主，晚期則以CD8+T 細胞介導的DTH 為主。由此推測，在CAD 起病的早期過程中，CD4+T 細胞扮演著重要的角色，尤其是CD4+T 細胞的2 個重要亞群Treg 細胞和Th17 細胞在慢性光化性皮炎的發生與發展中可能起著重要的作用。

Th17 細胞分泌IL-6、IL-17、IL-22、腫瘤壞死因子（TNF-α）等細胞因子實現免疫功能。IL-17 在很多種自身免疫性疾病患者的血清和組織中均呈現了極高表達。免疫反應中IL-17 有促進炎癥發生的重要作用。其功能主要表現在2 個方面：在全身性反應中對中性粒細胞的募集、成熟和激活作用，研究發現缺乏IL-17 或者Th17 會導致中性粒細胞缺陷以及對金黃色葡萄球菌和真菌等抵抗力減弱[6?7]；另一方面它還能夠誘導間充質細胞分泌炎癥因子，例如IL-6、IL-8 和CCL20，從而加重炎癥[8]。IL-17 通過受體與異二聚體復合物相結合來發揮生物學效應[9]。IL-17 在宿主對抗外界病原體的固有免疫防御機制中發揮重要作用[10]。

本實驗中筆者先通過標記CD4+CD196+CD183-等表面抗原來界定Th17 細胞，結果顯示CAD 患者Th17 細胞在外周血CD4+T 細胞中所占比例高于健康對照組。免疫組化法同樣發現IL-17 在CAD 皮損中的分布明顯高于健康對照組。提示IL-17 作為一個重要的促炎因子，在CAD 的發病中發揮了重要作用。有研究發現，在CAD 的慢性期，CAD 患者與健康體檢者組的IL-17 相比，無統計學差異，推測IL-17 主要在疾病的急性期發揮作用[11]。這也提示可嘗試通過影響Th17 的增殖分化達到治療目的，其分泌的細胞因子如IL-17、IL-22，TNF-α 可以作為CAD 新的治療靶點，嘗試CAD 靶向治療方案。

Treg 細胞具有無反應性及免疫抑制性，可通過細胞接觸觸及分泌的主要細胞因子包括轉化生長因子β（TGF-β）和IL-10 發揮其對多種免疫細胞如樹突狀細胞、NK 細胞及單核細胞的抑制作用，同時維持自身免疫耐受及調節內環境穩態。Treg 數量減少和功能下降可以導致Treg 細胞免疫調節功能受到損傷，這與自身免疫性疾病的發病相關[12]。本研究先使用CD4+CD25+CD127-或弱表達來界定Treg 細胞，結果顯示CAD 患者Treg 細胞在外周血CD4+T 細胞中所占比例顯著低于對照組。

Foxp3 屬于FOX 蛋白家族。許多研究已經證明了Foxp3+Treg 細胞在控制多種免疫反應的生理和病理中發揮重要作用，包括炎癥、自身免疫疾病和癌癥[13?14]。Foxp3+Treg 可以表達高水平的Foxp3，Foxp3 長期以來被認為是控制Treg 細胞發育和功能的主要調節因子。并且Foxp3 的連續表達是維持Treg 細胞表型所必需的。本組資料中CAD 病例組與健康對照組間Foxp3、IL-17 在皮損內的表達結果比較發現，Foxp3 在CAD 皮損中的表達與健康對照組相似。IL-17 在CAD 皮損中的分布明顯高于健康對照組。這一結果與其他慢性炎性疾病中Foxp3 和IL-17 的表達情況相同。也與我們用流式細胞術所檢測得到的結果是相符的。

與健康志愿者相比，CAD 患者的Th17/Treg顯著高于對照組，Treg 細胞和Th17 細胞失衡可能是慢性光化性皮炎的重要的發病機制。這些年來，大量的研究發現了慢性炎癥性疾病的發生與發展與Th17/Treg 相關，Th17/Treg 比值升高，平衡向促炎的Th17 細胞方向轉化，促使炎癥發生[15?16]。在CD4+T 細胞分化成熟過程中，轉化生長因子β（TGF-β）不但可以促使原始CD4+T 淋巴細胞向Treg 細胞分化，TGF-β 還可以與IL-6一起作用于CD4+T 細胞，使其轉化成為Th17 細胞；Th17 細胞和Treg 細胞比例主要受到TGF-β、IL-6，IL-10，IL-23 等細胞因子的影響，因此，它們在外周血中的分化是彼此制約的。調節性T細胞可以在IL-6、IL-1 以及TGF-β 的共同作用下重新向Th17 細胞轉化。即Th17 細胞和Treg 細胞在特定的微環境中它們能夠互相轉化，并且Th17 細胞和Treg 細胞之間存在一種動態平衡，機體可以通過改變這種平衡來改變適應性免疫應答的狀態；而免疫性疾病、感染以及腫瘤等疾病常常發生在該平衡被打破的時候。在本研究中，CAD 患者Th17/Treg 顯著高于對照組，存在Th17細胞和Treg 細胞的失衡，Th17 細胞升高水平和EASI 評分2 者間存在正相關關系；Treg 細胞和EASI 評分2 者間存在負相關關系；Th17/Treg 比值和EASI 評分2 者間存在正相關關系，提示Th17/Treg 比值與疾病嚴重程度相關，Th17 細胞水平越高，Treg 細胞水平越低，皮損越嚴重，本研究顯示皮損中IL-17 表達增高，也提示Th17 細胞通過其分泌的細胞因子參與了CAD 的炎癥過程，發揮了促炎作用。Th17 細胞升高，促使平衡向炎癥方向轉化，可能是CAD 發病的重要機制。

綜上所述，CAD 患者存在Th17 細胞和Treg細胞的失衡，Treg 細胞及Th17 細胞在CAD 的發病過程中起著重要作用，急性期CAD 患者Th17細胞水平升高，Th17/Treg 比值升高，可用來作為判斷CAD 病情的輔助指標，在將來也許可為CAD 的治療提供新的靶向選擇。