肥胖相關代謝性內毒素血癥對精子畸形率的影響因素分析

劉春輝 朱晨 陜文生 王志強 王海 周于娜 李少君 金莉婭

肥胖是導致男性生育力降低的高危因素之一[1-5]。現有研究表明,夫妻當中僅男方為肥胖者,參與試管受孕(IVF)輔助妊娠,最終活產率比非肥胖男性參與的IVF更低[6,7]。肥胖可使男性精子數量、活力、頂體酶功能受損的發生率升高,并有更大概率引發男性因素造成的女性復發性流產出現[8,9]。攝食過度、運動過少、選擇高能量食品、遺傳因素、內分泌因素、代謝因素是肥胖的誘因,同時也是男性生育力降低的誘因。一些生活中的混雜因素也間接影響了男性生育力。肥胖導致男性生育力降低的高危因素在不斷的被發現,但肥胖導致的代謝性內毒素血癥尚未被探討過,本研究旨在探討與肥胖相關的代謝性內毒素血癥是否對精子畸形率產生影響,并尋找相關的危險因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1～12月在我院就診的男性患者684例,參照第五版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》,經精子形態學評估判斷為畸形精子癥者(正常形態精子占比<4%)453例作為觀察組,精子無異常者231例作為對照組。排除標準:存在睪丸損傷、隱睪癥或Klinefelter綜合征;3個月內服用過皮質類固醇、魚油、非甾體類抗炎藥、益生菌、抗生素、人絨毛膜促性腺激素、芳香化酶抑制劑、枸櫞酸他莫昔芬、克羅米芬或睪酮[10]。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與基線數據:受試者血液、精液標本均在早晨空腹采集,禁欲時間需在2～7 d。精液收集后需在1 h內進行檢測。測量身高和體重后計算體重指數(BMI),BMI>25.00 kg/m2判定為異常。

1.2.2 精漿炎癥活性標志物:使用彈性蛋白酶(Elastase)ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司),根據供應商提供的試劑盒使用說明書操作,測定精液中性粒細胞活性標志物彈性蛋白酶,該試驗的變異系數為2%,參考值為1.0～400 ng/ml,>290 ng/ml表明生殖泌尿系感染或炎癥[11]。

1.2.3 腸道通透性標志物:使用人連蛋白(Zonulin)ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司 中國安徽)測量血清中Zonulin的水平,>8.5 ng/ml判定為異常,本試驗的批間變異系數為3%[12]。

1.2.4 內毒素:ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司)測定血清使用脂多糖結合蛋白(LBP)水平。采用雙抗體一步夾心法ELISA進行檢測,通過LBP分析間接量化代謝性內毒素血癥,>15.3 ng/ml判定為異常[13,14]。

1.2.5 精液氧化應激:使用8-羥基脫氧鳥苷(8OHdG)ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司),采集后的精液經3 500 r/min離心10 min后取上清液,使用酶聯免疫吸附法檢測80HdG,參考值為2.0～800 ng/ml,>120 ng/ml判定為異常[15]。

1.2.6 精子形態學檢測:經37℃恒溫箱孵育液化后的精液涂片,自然干燥后使用WHO推薦的DIFF-QUICK快速染色試劑盒(博銳德生物有限公司 中國深圳)進行染色,采用全自動精子形態分析軟件(穗加軟件公司 中國北京)在光學顯微鏡1 000倍鏡下計數>200條的精子,并計算精子的正常形態率,正常形態精子占比<4%判定為異常。所有操作由同一名人員進行檢測,以確保數據的精準性。

1.2.7 激素測定:采用自動化學發光免疫分析法測定血清睪酮(TT)、促卵泡生產素(FSH)、促黃體生成素(LH)和雌二醇(E2),上述激素參考范圍分別為1.93～8.36 ng/dl、0～70 pg/ml、1.5～12.4 mU/ml、1.7～8.6 mU/ml。

2 結果

2.1 2組年齡、體重指數比較 對全部684例觀察對象進行分析,年齡23～52歲,觀察組≥40歲人群占比15.2%(69/453),對照組≥40歲人群占比10.8%(25/231),2組間比較差異無統計學意義(χ2=0.065P=0.818);684例患者BMI為21.3～33.6 kg/m2,觀察組BMI≥25 kg/m2人群占比72.4%(328/453),對照組BMI≥25 kg/m2人群占比25.1%(58/231),2組間差異有統計學意義(χ2=8.231,P=0.009)。見表1。

表1 2組年齡、BMI比較

2.2 2組血清Zonulin、LBP和8OHdG水平比較

2.2.1 684例患者腸通透性標志物血清Zonulin水平為2.3～21.42 ng/ml,觀察組異常(Zonulin≥8.5 ng/ml)率為79.7%(406/453),對照組異常率為8.2%(19/231),2組間比較差異有統計學意義(χ2=9.635P=0.002)。見表2。

表2 2組血清BMI與LBP、Zonulin、8OHdG水平比較

2.2.2 684例患者代謝性內毒素血癥標志物LBP水平為6.1～63.2 ng/ml,觀察組異常(≥15.3 ng/ml)率為69.3%(314/453),對照組異常率為29.4%(68/231),2組間比較差異有統計學意義(χ2=7.524P=0.013)。見表2。

2.2.3 精漿氧化應激活性標志物:8OHdG為13.4～694ng/ml,觀察組異常(≥120 ng/ml)率為73.5%(333/453),對照組異常率為19.9%(46/231),2組間比較差異有統計學意義(χ2=5.964P=0.018)。見表2。

2.3 2組性激素水平、感染性標志物比較 TT結果為1.08～7.3 ng/dl,觀察組異常(<1.93 ng/dl或>8.36 ng/dl)率為4.6%(21/453),對照組異常率為2.2%(5/231),組間差異無統計學意義(χ2=0.065,P=0.657);FSH結果為0.8～18.4 mU/ml,觀察組異常(<1.5 mU/ml或>12.4 mU/ml)率為4.9%(22/453),對照組異常率為1.3%(3/231),組間對比(χ2=0.034,P=0.601),異常率無差異性;LH結果為1.3～11.4 mU/ml,觀察組異常(<1.7 mU/ml或>8.6 mU/ml)率為5.3%(24/453),對照組異常率為5.2%(12/231),組間差異無統計學意義(χ2=0.021,P=0.592); E2結果為12.4～103 pg/ml,觀察組異常(≥70 pg/ml)率為43.5%(197/453),對照組異常率為10%(23.0/231),組間差異有統計學意義(χ2=6.954,P=0.019);彈性蛋白酶Elastase結果為14～423.3 ng/ml,觀察組異常(≥290 ng/ml)率為14.8%(67/453),對照組異常率為16.9%(39/231),組間差異無統計學意義(χ2=0.026,P=0.648)。見表3。

表3 2組性激素水平比較

2.4 BMI與LBP、Zonulin、8OHdG的相關性 Zonulin和BMI呈正相關(r=0.647,P=0.000);LBP和BMI呈正相關(r=0.514,P=0.000);8OHdG與BMI呈正相關(r=0.562,P=0.000)。見表4。

表4 BMI與各變量間的相關性分析結果

2.5 TT與BMI無相關性(r=0.195,P=0.395);FSH與BMI無相關性(r=0.032,P=0.475);LH與BMI無相關性(r=0.066,P=0.441);E2與BMI存在正性相關(r=0.727,P=0.028);Elastase與BMI無相關性(r=0.046,P=0.717)。提示在觀察組,僅有E2的異常率較高,且E2 與BMI存在正性相關關系。見表4。

2.6 多因素Logistic回歸分析結果 BMI(OR=5.984,P=0.004)、8OhdG(OR=3.521,P=0.001)、Zonulin(OR=3.241,P=0.017)、LBP(OR=5.511,P=0.001)、E2(OR=4.671,P=0.026)是影響精子畸形率的高危因素。年齡、Elastase、TT、FSH、LH均不是影響精子畸形率的高危因素。見表5。

表5 影響精子畸形率的多因素Logistic回歸分析表

3 討論

肥胖是導致糖代謝紊亂、高脂血癥、激素水平異常及血栓性疾病等多種與代謝異常相關疾病的高危因素[16]。除此之外,肥胖還會造成腸上皮細胞通透性增加,而腸管通透性增加與代謝性內毒素血癥、全身炎癥反應有關[17]。攝入過多含有脂肪的食品則會導致這種改變發生[11,18]。人連蛋白Zonulin是一種分子質量為47 kD的蛋白,產自于腸上皮和肝臟,它的作用是調節腸上皮細胞間的連接緊密程度,從而調節大分子、白細胞和液體在腸腔與血液之間的遷移,是公認的腸通透性標志物[19]。肥胖者體內過多的脂肪組織會產生大量的炎性細胞因子(如TNFα和IL-6),觸發Zonulin釋放增多,腸上皮通透性增高,腸道內細菌隨之遷移進入循環系統,激活炎性反應[14,20,21]。細菌跨膜通常由以下兩條途徑實現,其一是Zonulin降低腸上皮細胞間的緊密連接,產生細胞間通道;其二是由膽汁酸微膠粒穿過腸上皮細胞膜脂多糖片段而形成的跨細胞通道[22,23]。腸腔內多見革蘭氏陰性菌,在其細胞壁上含有大量強效免疫刺激物內毒素粘多糖(LPS),進入循環系統后,這些腸道來源的細菌會被免疫細胞所標識,并激活炎性反應[11,20,24,25]。此時,肝臟內另一種糖蛋白被激活,并大量產生,那就是血清脂多糖結合蛋白LBP,其分子量大小為55～60 kD,在正常狀態下LBP濃度極低,當機體出現細菌感染所導致的炎性反應時,血清LBP迅速升高,并與LPS結合形成LPS-LBP復合物,反映內毒素血癥的嚴重程度[26]。

內毒素血癥引起炎癥反應,炎性反應誘發氧化應激,促使白細胞產生大量的活性氧(ROS)。8OHdG是評價氧化應激嚴重程度的標記物,它是由鳥嘌呤堿基受到ROS攻擊而生成的一種氧化加合物。精漿8OHdG的增高反映了睪丸組織受到了氧自由基攻擊[27]。ROS是強氧化劑,會對侵入循環系統的細菌和正常人體組織發起無差別化攻擊,其中就包括曲細精管、生精上皮、精子細胞和Leydig細胞,導致一定程度的激素分泌異常、生精功能障礙以及精子畸形率增加[28,29]。有學者將健康小鼠精子暴露于含有內毒素標志物LBP的培養液中進行觀察,并指出即使是低劑量的內毒素實驗性暴露,也會導致健康精子發生功能性損害[30]。

我們此次進行的研究,首先提示肥胖程度與腸上皮通透性呈現正性相關,肥胖越嚴重,腸道通透性越強。這將導致腸道細菌移位,遷移進入循環系統。其次,因為遷移進入循環系統的腸道細菌攜帶大量內毒素粘多糖,機體反應性的產生了大量的脂多糖結合蛋白,與內毒素粘多糖結合形成LPS-LBP復合物,刺激機體炎癥反應發生。肥胖程度與LBP也呈現正性相關,提示肥胖越嚴重,代謝性內毒素血癥越嚴重。另外,因炎癥激活ROS釋放,肥胖程度與精液中的氧化應激標志物8OHdG同樣呈現出了正性相關關系,提示精液內出現ROS攻擊精子細胞核后的產物,且肥胖越嚴重,精子受到的氧化攻擊越嚴重。但此次研究并未發現睪酮水平與肥胖呈現出相關性,這與部分學者提出的肥胖可引起睪丸激素分泌異常的結論不相符。探索原因,這可能與本研究的被觀察樣本量相對較小有關,也可能是因為被觀察對象氧化應激并未達到損傷睪丸內分泌功能的嚴重程度,但我們仍然認同他們的觀點。另外,我們發現肥胖嚴重程度與雌二醇表達呈正性相關,肥胖程度越嚴重,雌二醇水平越高。考慮這可能與肥胖人群脂肪肝多發,雌激素滅活不足有關。而過多的雌激素可對抗睪酮生物活性,間接的影響睪丸功能與精子質量。

在進行了多因素Logistic回歸分析后,我們發現肥胖、代謝性內毒素血癥、氧化應激、腸道通透性、雌二醇是影響精子畸形率的高危因素,年齡、精漿感染性炎癥、睪酮、促卵泡生成素、促黃體生成素不是影響精子畸形率的高危因素。即使在校正了相關混雜因素(例如吸煙,飲酒,禁欲時間)后,這種結論也未發生明顯變化。

益生菌是改善腸上皮屏障功能,減少腸道細菌異位的有效藥物[27]。有報道稱,益生菌可以改善精子質量和提高睪丸激素水平[28]。我們推測這種改善可能與腸道細菌異位減少以及氧化應激減弱有關。在改善肥胖人群精子畸形率時推薦使用益生菌,聯合抗氧自由基的食品、藥品攝入(如:富含超氧化物歧化酶SOD的香蕉、山楂、刺梨、獼猴桃、大蒜以及維生素C、天然型維生素E、左卡尼汀等),可能成為有別于傳統抗氧化劑治療的潛在替代療法。但效果如何,尚需后續研究進一步觀察。

綜上所述,肥胖可誘發代謝性內毒素血癥,腸道通透性的增加以及內毒素水平的升高可造成全身炎癥反應,誘導氧化應激的出現。由氧化應激造成白細胞釋放的活性氧ROS將會造成精子畸形率升高。增強腸道屏障功能的新療法可能會減少肥胖相關的炎癥氧化應激,從而改善精子畸形率,改善妊娠結局。