胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白表達及與患者遠期生存的關系

張劍鋒 肖南平 蔣麗琳

我國胃癌的發(fā)病率和死亡率均較高[1],患者早期無明顯癥狀,隨著病情的發(fā)展可出現(xiàn)消化不良等胃部不適癥狀,晚期會出現(xiàn)嘔吐、黑便、疼痛、腹部腫塊及盆腔或遠處淋巴結轉移等體征[2]。臨床針對胃癌患者常采取以手術切除為主的綜合治療方式,雖然有效延長了患者的生存期,但遠期生存效果仍較差,相關數(shù)據(jù)顯示胃癌患者外科手術后的5年生存率約為21%～30%[3],因此,對胃癌患者遠期生存影響因素的探討具有重要意義。部分研究發(fā)現(xiàn),胃癌的發(fā)生、發(fā)展與多條信號通路調控改變相關[4,5]。Kelch樣環(huán)氧氟丙烷相關蛋白-1(Keap-1)是體內各信號通路中一種非常重要的調節(jié)蛋白,可以與靶標蛋白特異性結合[6]。有關研究報道,Keap-1在腺瘤及腺癌組織中高表達,并與腺癌的浸潤程度及分化程度相關[7]。此外,核因子E2相關因子2(Nrf2)介導細胞的抗氧化反應,與疾病的發(fā)生關系密切[8],并在耿文靜等[9]的研究中,Nrf2過表達可以促進子宮內膜腺樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移。以上研究均提示Keap-1、Nrf2蛋白表達可能參與癌癥的發(fā)生發(fā)展,但此二者是否與胃癌患者術后遠期生存相關尚有待進一步分析。鑒于此,本研究特對胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白表達與患者遠期生存的關系展開探討,以期為臨床治療與防控提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2015年1月至2017年2月在本院行根治性手術治療的147例胃癌患者臨床資料,其中男83例,女64例;年齡37～78歲,平均年齡(55.33±10.23)歲;體重指數(shù)(BMI)為(21.09±1.39)kg/m2;組織分化:低分化50例,中高分化97例。TNM分期:Ⅰ期33例,Ⅱ期40例,Ⅲ期54例,Ⅳ期20例;組織類型:鱗癌24例,腺癌123例;伴淋巴結轉移98例;術后輔助化療73例。本研究經倫理委員會批準,患者及其家屬均知情同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①術前行胃鏡及病理學檢查確診為胃癌;②初治,均符合根治性手術適應癥,并接受根治性手術+淋巴結清掃術;③術前均未進行放化療、靶向治療。④術中均留取患者胃癌組織和癌旁正常組織(距癌≥5 cm),并放置于液氮中保存;⑤臨床資料保存完整,且有隨訪記錄。

1.2.2 排除標準:①術前檢查及術中發(fā)現(xiàn)腫瘤遠處轉移,手術未達到根治性切除;②殘胃癌;③合并心、肝、腎等嚴重臟器功能障礙;④合并免疫系統(tǒng)疾病者;⑤合并其他惡性腫瘤;⑥伴腦血管疾病、內分泌疾病。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器:組織包埋儀(LEUKA FG1150H)、全自動組織脫水儀(LEIKA TP1020)、冷凍切片機(LEICA CM1950,德國),DML型倒置顯微鏡(德國Leica公司);Keap1(1∶100)兔抗人多克隆抗體購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司;Nrf2(1∶150)兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司;磷酸鹽(PBS)緩沖液、抗原修復液、通用型二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、蘇木素染色液購自福州邁新公司。

1.3.2 組織Keap-1、Nrf2蛋白表達檢測:采用免疫組化法檢測患者胃癌組織和癌旁正常組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達。將術中留取的胃癌組織與癌旁正常組織放入10%中性甲醛固定,石蠟包埋,3 μm切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇浸泡,微波抗原修復,血清抗原修復,滴加兔抗人Keap1、Nrf2一抗(Keap1兔抗人多克隆抗體,稀釋比為1∶100;Nrf2兔抗人多克隆抗體,稀釋比為1∶150),4℃冷藏過夜,次日PBS漂洗10 min,共3次。滴加通用型二抗50 μl,37℃反應2 h后,PBS漂洗10 min,共3次,隨后通過DAB進行顯色,時長為3 min,蘇木素復染30 s,脫水,75%甘油封片。在400倍光學顯微鏡下觀察組織中Keap1、Nrf2蛋白表達,每張切片隨機采集6個圖像,并通過南京大學捷達80i病理圖像分析系統(tǒng)進行計算機圖像采集和分析。Keap-1以細胞質染成棕黃色為陽性,Nrf2以細胞質或細胞核染成棕黃色為陽性。①根據(jù)染色細胞占比結果記分,占比≤5%計0分,占比>5%但≤25%計1分,占比>25%但≤50%計2分,占比>50%但≤75%計3分,占比>75%計4分;②依據(jù)染色細胞顯色深淺記分,細胞無顯色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。總積分值=A×B,當A×B=0時為陰性,A×B≥1均為陽性。

1.3.3 隨訪與分組:術后對患者進行為期5年的跟蹤隨訪,并以患者死亡為隨訪終點,通過門診復查、電話/微信回訪或家庭訪視等形式記錄患者遠期生存情況。將隨訪期間死亡的患者歸為死亡組,另將生存的患者歸為生存組。

1.3.4 術后遠期生存的影響因素分析:整理可能影響胃癌患者根治性術后遠期生存的相關因素,如年齡、性別、BMI、腫瘤大小、病灶部位、組織類型、分化程度、TNM分期、手術方式、淋巴結轉移、術后輔助化療、Keap-1蛋白表達、Nrf2蛋白表達,將其作為自變量,另將遠期生存不良作為因變量,對變量進行賦值。見表1。

表1 變量賦值

1.4 觀察指標 (1)比較患者胃癌組織與相應癌旁正常組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達情況;(2)比較胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白表達陽性者與表達陰性者的中位生存時間;(3)比較生存組和死亡組胃癌組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達;(4)胃癌患者遠期生存的影響因素:比值比(OR)、95%可信區(qū)間(95%CI)。

2 結果

2.1 胃癌組織與相應癌旁正常組織Keap-1、Nrf2蛋白表達比較 胃癌組織中Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達率均高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 胃癌組織與相應癌旁正常組織Keap-1,Nrf2蛋白表達(免疫組化×400);A Nrf2蛋白在胃癌組織中陽性表達;B Nrf2蛋白在癌旁正常組織中陰性表達;C Keap-1蛋白在胃癌組織中陽性表達;D Keap-1蛋白在癌旁正常組織中陰性表達

表2 胃癌組織與相應癌旁正常組織Keap-1、Nrf2蛋白表達比較 n=147,例(%)

2.2 胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達者與陰性表達者的中位生存時間比較 147例胃癌患者術后5年隨訪期間,均無失訪,其中患者死亡109例,生存38例,生存率25.85%。經Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Keap-1蛋白陽性表達患者中位生存期低于Keap-1蛋白陰性表達患者(Log-rank =31.3241,P<0.001);Nrf2蛋白陽性表達患者中位生存期低于Nrf2蛋白陰性表達患者(Log-rank =24.358,P<0.001)。見圖2。

圖2 胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達者與陰性表達者生存曲線

2.3 生存組和死亡組Keap-1、Nrf2蛋白表達比較 死亡組患者胃癌組織中的Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達率均高于生存組(P<0.05)。見表3。

表3 生存組和死亡組Keap-1、Nrf2蛋白表達比較 例(%)

2.4 胃癌患者遠期生存的影響因素 死亡組腫瘤≥4.5 cm、低分化程度、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、術后輔助化療占比均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);并經Cox比例風險回歸模型分析,腫瘤≥4.5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度、淋巴結轉移、術后未輔助化療、Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達均是影響胃癌患者遠期生存的危險因素(P<0.05)。見表4、5。

表4 死亡組和生存組遠期影響因素比較

表5 Cox回歸模型分析

3 討論

胃癌作為嚴重威脅人類健康的一種惡性腫瘤,是由多種因素所導致的,其中最主要的原因有幽門螺旋桿菌的感染、遺傳、基因以及不良生活習慣等[10]。根治性手術方式是臨床治療胃癌的主要手段,且近年來逐步開展的術前新輔助化療及免疫治療等綜合治療,從根本上改變了傳統(tǒng)的治療方式,使胃癌的總體療效明顯提高,但遠期生存療效仍不佳[11]。

本研究結果顯示,胃癌組織Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達率均高于癌旁正常組織,提示Keap-1、Nrf2蛋白表達可能與胃癌發(fā)生有關。正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap-1處于分子伴侶形式,而Keap-1作為負調控蛋白可以通過泛素蛋白酶體降解Nrf2,使其維持在較低水平。但由于氧化應激在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[12],受其影響,Keap-1結構發(fā)生變化,與Nrf2迅速解離,并喪失對Nrf2的負性調節(jié)作用,同時反應性半胱氨酸殘基發(fā)生改變,降低了E3連接酶活性,導致Nrf2磷酸化,使其進入細胞核內并逐漸累積,呈現(xiàn)高表達[13]。有研究發(fā)現(xiàn),Nrf2過度激活會增強細胞和組織的抗氧化能力,保護腫瘤細胞,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。另Keap-1結構發(fā)生變化會導致其功能喪失,影響對Nrf2的抑制活性,增強了腫瘤細胞的生存率,并在有關研究中,Keap-1蛋白高表達與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關[15],也表明Keap-1蛋白表達與癌變的發(fā)生有關,與本研究結果相似。

本研究中,經Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Keap-1蛋白陽性表達患者中位生存期低于Keap-1蛋白陰性表達患者,Nrf2蛋白陽性表達患者中位生存期低于Nrf2蛋白陰性表達患者,且死亡組患者胃癌組織中的Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達率均高于生存組,經Cox比例風險回歸模型分析,Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達均是影響胃癌患者遠期生存的危險因素,表明Keap-1、Nrf2蛋白的異常表達與胃癌患者遠期生存具有一定聯(lián)系。國外研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤干細胞具有密切聯(lián)系,胃癌發(fā)生部位與胃癌干細胞定居部位一致,并具有許多共同特性,提示胃癌可能是一種干細胞疾病[16]。而Nrf2-NQO1信號通路在胃癌干細胞氧化應激反應中發(fā)揮了重要作用,激活該通路,可以誘導Nrf2的高表達,進而促進NQO1的表達,增強細胞對氧化應激反應的耐受性,起到細胞保護作用[17]。且癌組織中Nrf2高表達可能是基因突變的結果,此時核內轉位異常,Ⅱ相解毒酶基因不能有效激活,氧化應激源的細胞毒性加重,導致細胞功能障礙、凋亡甚至死亡,從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,加重病情,影響遠期生存[18]。Keap-1蛋白結構發(fā)生變化,部分功能喪失,對Nrf2的抑制活性降低,使Nrf2持續(xù)異常激活,導致其下游親電藥物解毒途徑的活性增強,促使腫瘤細胞轉移、增殖,并且機體對化療藥物產生耐藥性,影響化療效果[19];此外,也有研究表明,Nrf2蛋白陽性表達與胃癌的侵襲呈正相關,與輔助化療的耐藥性密切相關,可以作為患者預后不良的潛在指標[20]。另Keap-1還可以調控NF-κB信號通路,參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[21]。并在李璐等[22]的研究中,Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達可以影響肺癌患者的預后。而在銀萍等[23]的研究中,Keap-1、Nrf2蛋白陽性表達與子宮頸病變患者預后有關,以上均表明了Keap-1、Nrf2蛋白表達與癌變患者的遠期生存具有一定聯(lián)系。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期、術后輔助化療也是影響胃癌患者遠期生存的影響因素,與既往研究[24]一致,分析原因:患者腫瘤越大,對胃壁的侵犯越廣,手術徹底根治的難度增加,術后復發(fā)的風險提升,同時癌細胞更易侵犯淋巴管,導致淋巴結轉移的可能性增加,預后較差,從而影響患者遠期生存狀況;當患者分化程度較低時,具有較明顯的細胞異型性,生物惡性程度較高,侵襲性強,多引起早期局部淋巴結或遠處轉移,而淋巴結轉移會增加患者術后發(fā)生腫瘤局部殘留和遠處微轉移灶的幾率,進而影響患者遠期生存;此外,TNM分期可以反應腫瘤的進展狀況,當TNM分期較高時,患者腫瘤浸潤漿膜后癌細胞極易脫落并造成腹腔種植散播,不利于預后,影響遠期生存;另外胃癌患者術后輔助化療不僅可以鞏固手術療效,并且對術區(qū)切除不完全病灶、微轉移灶均有抑制作用,故術后輔助化療可以改善患者遠期生存情況。

綜上所述,胃癌組織中Keap-1、Nrf2蛋白表達失衡對胃癌患者的遠期生存具有一定影響,而對二者的調控是否可能成為胃癌患者遠期生存治療一個新方向,值得進一步的探究。此外,腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期也是胃癌患者遠期生存的影響因素,臨床可采取針對性措施,進行有效的防治。