河鲀肝油中維生素A、D檢測方法研究

黃海楓，夏 鑫*，范奕輝

（1.河北省海洋與水產科學研究院（河北省海洋漁業生態環境監測站），河北秦皇島 066000；2.河北省海洋生物資源與環境重點實驗室，河北秦皇島 066000；3.國立釜慶大學 水產科學學院食品工學部，釜山 612022）

目前，國際上魚油的研究在其來源和活性分子、工作原理、分子靶標等19個大項中開展，在多領域結出豐碩成果。BHATT等[1]在頂級醫學期刊《新英格蘭醫學雜志》中指出，正常健康人群服用魚油制劑有利于預防心血管疾病和糖尿病。河鲀肝油基本性狀與海產天然魚肝油相似，肝油中含有多種維生素、脂肪酸和微量的河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX），除毒去脂的河鲀肝油被證明在緩解癌痛、抑瘤、增強機體免疫力等方面藥理作用突出，且無毒性及成癮性反應[2]。多年來，國內外的研究大部分專注于TTX，對肝油中其他營養成分研究較少。其實河鲀肝油中不但富含多種脂肪酸，也含有維生素A、維生素D等保健性生物成分。在國際國內雙循環格局下，食品營養與健康產業正在從較低層次朝高附加值、高技術水平、高加工深度、高規模經濟方向演變。高端食品、保健食品、功能食品發展加速，開展富含營養功能因子食品的新型工藝和質量控制技術的研究及集成，研究開發產品質量可控、環境友好的清潔生產工藝是科技發展的必然趨勢[3]。因此，如果能夠通過新型制備技術提取肝油并高值化利用開發，變廢為寶，既能提升資源生物利用率，提高產業附加值，又可減少廢棄油脂對環境的污染，具有顯著的經濟效益與生態效益。而河鲀肝油中的維生素A隨季節和生殖情況是有顯著變化的，如蟲紋東方鲀產卵前每克肝中含維生素A高達4 100國際單位（International Units，IU），產卵后降為960 IU[4]。因此，建立快速可靠、簡便易行的魚肝油質量檢測方法，對有效評價河鲀魚肝油品質優劣、幫助人們合理使用魚油具有現實參考意義。本實驗通過亞臨界萃取設備提取河鲀肝油，并采用高效液相色譜法對河鲀肝油中維生素A1和維生素D3成分進行檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河鲀肝臟（唐山海都）；視黃醇（純度≥95%，阿拉?。?；膽鈣化醇（純度≥99%，麥克林）；甲醇（迪馬科技）；無水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、抗壞血酸溶液、氫氧化鉀和無水硫酸鈉（均為國藥集團化學試劑）。

萃取設備（河南省亞臨界生物技術有限公司CBE-5L型）；Agilent1200高效液相色譜儀；HH-S型恒溫水浴振蕩器；旋轉蒸發儀（力辰科技RE-2000A型）；KQ-400E超聲儀；Milli-Q純水處理器；JA1003型電子分析天平；H/T12MM型高速離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚肝油制備方法

選取處理好的河鲀肝臟1 kg，放入萃取罐啟用真空萃取程序，以丁烷為萃取溶劑，30 ℃萃取30～40 min，重復3～4次，結束脫溶后回收殘液增加提取率。用布氏漏斗重復抽濾去脂，澄清液置于旋轉蒸發瓶，100 ℃旋蒸至無水分餾出，得到純凈澄清河鲀肝油樣品備用。

1.2.2 樣品處理

（1）維生素A的提取。準確稱取5 g魚肝油樣品，加入20 mL無水乙醇溶解稀釋搖勻。加入5 mL 10%抗壞血酸和10 mL氫氧化鉀溶液，于沸水浴回流30 min。將皂化液并入分液漏斗，用蒸餾水沖洗回流系統，沖洗液并入分液漏斗中，用50 mL石油醚萃取，合并醚層用蒸餾水洗至中性液，經無水硫酸鈉濃縮至干，加入甲醇溶解并定容至10 mL，用0.22 μm濾膜過濾后上機分析。當樣品中同時存在幾種維生素A形式時，可通過堿水解的方式將其變成單一的視黃醇，以便于測定[5]。

（2）維生素D的提取。準確稱取5 g魚肝油樣品，加入50 mL正己烷渦旋混勻，放入高速冷凍離心機，4 ℃下以7 500 r·min-1離心5 min得到上清液。取5 mL上清液，使用0.22 μm濾膜過濾后待分析[6]。

1.2.3 確立色譜條件

（1）維生素A檢測條件的確立。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梯度洗脫：0～13 min，甲醇96%，13～20 min，甲醇96%→100%，20～24min，甲醇100%，24～24.5 min，甲醇100%→96%，24.5～30 min，甲醇96%；流速：0.8 mL·min-1；波長：325 nm；進樣量：20 μL。

（2）維生素D檢測條件的確立。色譜柱：Waters Symmetry R-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；等度洗脫：0～30 min，甲醇96%；流速：1.0 mL·min-1；波長264 nm；進樣量：20 μL。

1.2.4 色譜分析方法

本實驗采用外標法定量，配制不同濃度的維生素A、維生素D標準系列工作溶液，分別注入高效液相色譜儀中，測定響應的峰面積，以峰面積為縱坐標，以標準系列工作液濃度為橫坐標繪制標準曲線，測定樣品中維生素A、維生素D的含量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

對肝油分離效果產生影響的主要因素包括色譜柱類型、柱容量、流動相流速、流動相組成和比例。本實驗主要考察了色譜柱類型、流動相比例、流動相流速對肝油分離效果的影響。

2.1.1 維生素A檢測條件的優化

（1）色譜柱的篩選。不同的色譜柱分離效果不同，本實驗中使用兩種常用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18、Waters Symmetry R-C18對樣品中維生素A、維生素D進行分離，并比較分離效果。將4 μg·mL-1維生素A標準溶液注入高效液相色譜儀，對比兩柱的分析效果（圖1）。兩柱都在10 min內出峰完全。使用Agilent柱時，維生素A的保留時間為7.152 min，峰面積為783.2，對稱因子為1.048，峰形較好；使用Waters柱時，維生素A的保留時間為8.591 min，峰面積為175.4，對稱因子為1.001，但出現了雙峰連在一起的情況。經對比，選擇Agilent柱對維生素A進行檢測。

圖1 使用不同色譜柱檢測維生素A效果

（2）流動相比例的優化。使用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，調節流動相中甲醇與水比例為95∶5、96∶4、98∶2，比較不同流動相條件下維生素A的分離效果（圖2）。當甲醇∶水=95∶5時，圖中出現雙峰，基線較不平穩；當甲醇∶水=96∶4時，峰形最佳，出峰時間比較合適。當甲醇∶水=98∶2時，維生素A出峰時間過早且基線不平穩。經對比選擇甲醇∶水=96∶4為流動相進行維生素A的檢測。

圖2 使用不同流動相比例檢測維生素A效果

（3）流速的優化。流速是影響目標物峰形的重要因素之一，流速增大目標物的出峰時間會隨之提前，峰形變得尖銳，如流速過大，易造成柱壓過高，影響峰形美觀，也會縮短色譜柱的使用壽命[7]。將1 μg·mL-1的維生素A標準溶液注入高效液相色譜，調整流速為0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進行分析（圖3）。

圖3 使用不同流速檢測維生素A效果

當流速為0.5 mL·min-1時，維生素A出現雙峰難以分離的情況；流速為0.8 mL·min-1時，出峰時間合適，基線較平，峰形較好；流速為1 mL·min-1時，出峰時間較早，且基線不平穩；流速為1.5 mL·min-1時，出峰時間過早，基線不平且柱壓過大。經對比選用0.8 mL·min-1的流速進行維生素A的檢測。

2.1.2 維生素D檢測條件的優化

（1）色譜柱的篩選。將200 μg·mL-1的維生素D標準溶液注入高效液相色譜，使用兩個品牌的色譜柱進行分離效果比較（圖4）。結果表明，兩柱檢測維生素D均可在30 min內出峰完全。使用Agilent柱時，維生素D的保留時間為19.555 min，峰面積為9 596.4，對稱因子為0.415，峰形外觀較差；使用Waters柱時，維生素D的保留時間為20.210 min，峰面積為6 490.6，對稱因子為1.097，峰形外觀較規整，出峰時間合適，響應更高。經對比選擇Waters色譜柱進行維生素D的檢測。

圖4 使用不同色譜柱檢測維生素D效果

（2）流動相比例的優化。以Waters Symmetry R-C18色譜柱作分析柱，設流動相甲醇∶水為95∶5、96∶4、98∶2，測定維生素D（圖5）。

圖5 使用不同流動相比例檢測維生素D效果

當流動相為甲醇∶水=95∶5時，峰形較好，但出峰時間較晚；當流動相為甲醇∶水=96∶4時，出峰時間比較合適，峰形較好，且相鄰峰之間影響較小。當流動相比例為甲醇∶水=98∶2時，峰形較差，有雙峰相連現象。經對比選擇甲醇∶水=96∶4為流動相進行維生素D的檢測。

（3）流速的優化。將200 μg·mL-1的維生素D標準溶液注入高效液相色譜，調整流速為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進行色譜分析（圖6）。當流速為0.5 mL·min-1時，出峰很小且峰形難看；流速為1.0 mL·min-1時，峰形好看，分離情況良好；流速為1.5 mL·min-1時，峰形較好但雜質峰很大并顯示柱壓過高。經對比選擇1.0 mL·min-1的流速進行維生素D檢測。

圖6 使用不同流速檢測維生素D效果

2.2 檢測結果

2.2.1 維生素A檢測結果

選Agilent Eclipse XDB-C18柱為分析柱，流動相為甲醇∶水（96∶4），流速為0.8 mL·min-1，建立維生素A標準溶液工作曲線，線性回歸方程為y=103.478 87x-3.567 22。結果顯示維生素A在0.2～6.0 μg·mL-1濃度范圍內線性良好，相關系數R2為0.999 5。根據此標準曲線，以同一份樣品同天內檢測5次，檢測結果為0.74 mg/100 g、0.75 mg/100 g、0.76 mg/100 g、0.74 mg/100 g和0.76 mg/100 g，維生素A的平均含量為0.75 mg/100 g，日內精密度（RSD）為1.3%。

2.2.2 維生素D檢測結果

選Waters Symmetry R-C18柱分析，流動相甲醇∶水（96∶4），流速1.0 mL·min-1，建立維生素D標準溶液工作曲線，線性回歸方程為y=111.998 66x-63.620 36，結果顯示維生素D在1～200 μg·mL-1濃度范圍內線性良好，相關系數R2為0.998 5。據此標準曲線，以同一份樣品同天內檢測5次，結果為0.70 mg/100 g、0.68 mg/100 g、0.69 mg/100 g、0.70 mg/100 g和0.68 mg/100 g，維生素D的平均含量為0.69 mg/100 g，日內精密度（RSD）為1%。

3 結論

本實驗通過亞臨界萃取法制備河鲀肝油，利用HPLC法檢測魚肝油樣品中維生素A及維生素D的含量。通過對不同色譜柱、流動相比例、流速大小的分析篩選，優化得到最佳色譜條件，測得樣品中維生素A平均含量為0.75 mg/100 g，維生素D平均含量為0.69 mg/100 g。本方法綠色環保，簡便易行，能滿足對魚肝油中維生素A及維生素D含量檢測的要求，并可為進一步研究此類功能性油脂提供參考。