河鲀肝油中維生素A、D檢測(cè)方法研究

黃海楓，夏 鑫*，范奕輝

（1.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院（河北省海洋漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站），河北秦皇島 066000；2.河北省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066000；3.國(guó)立釜慶大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)學(xué)院食品工學(xué)部，釜山 612022）

目前，國(guó)際上魚(yú)油的研究在其來(lái)源和活性分子、工作原理、分子靶標(biāo)等19個(gè)大項(xiàng)中開(kāi)展，在多領(lǐng)域結(jié)出豐碩成果。BHATT等[1]在頂級(jí)醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中指出，正常健康人群服用魚(yú)油制劑有利于預(yù)防心血管疾病和糖尿病。河鲀肝油基本性狀與海產(chǎn)天然魚(yú)肝油相似，肝油中含有多種維生素、脂肪酸和微量的河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX），除毒去脂的河鲀肝油被證明在緩解癌痛、抑瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面藥理作用突出，且無(wú)毒性及成癮性反應(yīng)[2]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究大部分專(zhuān)注于TTX，對(duì)肝油中其他營(yíng)養(yǎng)成分研究較少。其實(shí)河鲀肝油中不但富含多種脂肪酸，也含有維生素A、維生素D等保健性生物成分。在國(guó)際國(guó)內(nèi)雙循環(huán)格局下，食品營(yíng)養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)正在從較低層次朝高附加值、高技術(shù)水平、高加工深度、高規(guī)模經(jīng)濟(jì)方向演變。高端食品、保健食品、功能食品發(fā)展加速，開(kāi)展富含營(yíng)養(yǎng)功能因子食品的新型工藝和質(zhì)量控制技術(shù)的研究及集成，研究開(kāi)發(fā)產(chǎn)品質(zhì)量可控、環(huán)境友好的清潔生產(chǎn)工藝是科技發(fā)展的必然趨勢(shì)[3]。因此，如果能夠通過(guò)新型制備技術(shù)提取肝油并高值化利用開(kāi)發(fā)，變廢為寶，既能提升資源生物利用率，提高產(chǎn)業(yè)附加值，又可減少?gòu)U棄油脂對(duì)環(huán)境的污染，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益。而河鲀肝油中的維生素A隨季節(jié)和生殖情況是有顯著變化的，如蟲(chóng)紋東方鲀產(chǎn)卵前每克肝中含維生素A高達(dá)4 100國(guó)際單位（International Units，IU），產(chǎn)卵后降為960 IU[4]。因此，建立快速可靠、簡(jiǎn)便易行的魚(yú)肝油質(zhì)量檢測(cè)方法，對(duì)有效評(píng)價(jià)河鲀魚(yú)肝油品質(zhì)優(yōu)劣、幫助人們合理使用魚(yú)油具有現(xiàn)實(shí)參考意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)亞臨界萃取設(shè)備提取河鲀肝油，并采用高效液相色譜法對(duì)河鲀肝油中維生素A1和維生素D3成分進(jìn)行檢測(cè)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河鲀肝臟（唐山海都）；視黃醇（純度≥95%，阿拉丁）；膽鈣化醇（純度≥99%，麥克林）；甲醇（迪馬科技）；無(wú)水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、抗壞血酸溶液、氫氧化鉀和無(wú)水硫酸鈉（均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑）。

萃取設(shè)備（河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司CBE-5L型）；Agilent1200高效液相色譜儀；HH-S型恒溫水浴振蕩器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（力辰科技RE-2000A型）；KQ-400E超聲儀；Milli-Q純水處理器；JA1003型電子分析天平；H/T12MM型高速離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)肝油制備方法

選取處理好的河鲀肝臟1 kg，放入萃取罐啟用真空萃取程序，以丁烷為萃取溶劑，30 ℃萃取30～40 min，重復(fù)3～4次，結(jié)束脫溶后回收殘液增加提取率。用布氏漏斗重復(fù)抽濾去脂，澄清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，100 ℃旋蒸至無(wú)水分餾出，得到純凈澄清河鲀肝油樣品備用。

1.2.2 樣品處理

（1）維生素A的提取。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g魚(yú)肝油樣品，加入20 mL無(wú)水乙醇溶解稀釋搖勻。加入5 mL 10%抗壞血酸和10 mL氫氧化鉀溶液，于沸水浴回流30 min。將皂化液并入分液漏斗，用蒸餾水沖洗回流系統(tǒng)，沖洗液并入分液漏斗中，用50 mL石油醚萃取，合并醚層用蒸餾水洗至中性液，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉濃縮至干，加入甲醇溶解并定容至10 mL，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。當(dāng)樣品中同時(shí)存在幾種維生素A形式時(shí)，可通過(guò)堿水解的方式將其變成單一的視黃醇，以便于測(cè)定[5]。

（2）維生素D的提取。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g魚(yú)肝油樣品，加入50 mL正己烷渦旋混勻，放入高速冷凍離心機(jī)，4 ℃下以7 500 r·min-1離心5 min得到上清液。取5 mL上清液，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾后待分析[6]。

1.2.3 確立色譜條件

（1）維生素A檢測(cè)條件的確立。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梯度洗脫：0～13 min，甲醇96%，13～20 min，甲醇96%→100%，20～24min，甲醇100%，24～24.5 min，甲醇100%→96%，24.5～30 min，甲醇96%；流速：0.8 mL·min-1；波長(zhǎng)：325 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）維生素D檢測(cè)條件的確立。色譜柱：Waters Symmetry R-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；等度洗脫：0～30 min，甲醇96%；流速：1.0 mL·min-1；波長(zhǎng)264 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4 色譜分析方法

本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法定量，配制不同濃度的維生素A、維生素D標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定響應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定樣品中維生素A、維生素D的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)肝油分離效果產(chǎn)生影響的主要因素包括色譜柱類(lèi)型、柱容量、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組成和比例。本實(shí)驗(yàn)主要考察了色譜柱類(lèi)型、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相流速對(duì)肝油分離效果的影響。

2.1.1 維生素A檢測(cè)條件的優(yōu)化

（1）色譜柱的篩選。不同的色譜柱分離效果不同，本實(shí)驗(yàn)中使用兩種常用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18、Waters Symmetry R-C18對(duì)樣品中維生素A、維生素D進(jìn)行分離，并比較分離效果。將4 μg·mL-1維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，對(duì)比兩柱的分析效果（圖1）。兩柱都在10 min內(nèi)出峰完全。使用Agilent柱時(shí)，維生素A的保留時(shí)間為7.152 min，峰面積為783.2，對(duì)稱(chēng)因子為1.048，峰形較好；使用Waters柱時(shí)，維生素A的保留時(shí)間為8.591 min，峰面積為175.4，對(duì)稱(chēng)因子為1.001，但出現(xiàn)了雙峰連在一起的情況。經(jīng)對(duì)比，選擇Agilent柱對(duì)維生素A進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 使用不同色譜柱檢測(cè)維生素A效果

（2）流動(dòng)相比例的優(yōu)化。使用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，調(diào)節(jié)流動(dòng)相中甲醇與水比例為95∶5、96∶4、98∶2，比較不同流動(dòng)相條件下維生素A的分離效果（圖2）。當(dāng)甲醇∶水=95∶5時(shí)，圖中出現(xiàn)雙峰，基線(xiàn)較不平穩(wěn)；當(dāng)甲醇∶水=96∶4時(shí)，峰形最佳，出峰時(shí)間比較合適。當(dāng)甲醇∶水=98∶2時(shí)，維生素A出峰時(shí)間過(guò)早且基線(xiàn)不平穩(wěn)。經(jīng)對(duì)比選擇甲醇∶水=96∶4為流動(dòng)相進(jìn)行維生素A的檢測(cè)。

圖2 使用不同流動(dòng)相比例檢測(cè)維生素A效果

（3）流速的優(yōu)化。流速是影響目標(biāo)物峰形的重要因素之一，流速增大目標(biāo)物的出峰時(shí)間會(huì)隨之提前，峰形變得尖銳，如流速過(guò)大，易造成柱壓過(guò)高，影響峰形美觀，也會(huì)縮短色譜柱的使用壽命[7]。將1 μg·mL-1的維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜，調(diào)整流速為0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進(jìn)行分析（圖3）。

圖3 使用不同流速檢測(cè)維生素A效果

當(dāng)流速為0.5 mL·min-1時(shí)，維生素A出現(xiàn)雙峰難以分離的情況；流速為0.8 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間合適，基線(xiàn)較平，峰形較好；流速為1 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間較早，且基線(xiàn)不平穩(wěn)；流速為1.5 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間過(guò)早，基線(xiàn)不平且柱壓過(guò)大。經(jīng)對(duì)比選用0.8 mL·min-1的流速進(jìn)行維生素A的檢測(cè)。

2.1.2 維生素D檢測(cè)條件的優(yōu)化

（1）色譜柱的篩選。將200 μg·mL-1的維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜，使用兩個(gè)品牌的色譜柱進(jìn)行分離效果比較（圖4）。結(jié)果表明，兩柱檢測(cè)維生素D均可在30 min內(nèi)出峰完全。使用Agilent柱時(shí)，維生素D的保留時(shí)間為19.555 min，峰面積為9 596.4，對(duì)稱(chēng)因子為0.415，峰形外觀較差；使用Waters柱時(shí)，維生素D的保留時(shí)間為20.210 min，峰面積為6 490.6，對(duì)稱(chēng)因子為1.097，峰形外觀較規(guī)整，出峰時(shí)間合適，響應(yīng)更高。經(jīng)對(duì)比選擇Waters色譜柱進(jìn)行維生素D的檢測(cè)。

圖4 使用不同色譜柱檢測(cè)維生素D效果

（2）流動(dòng)相比例的優(yōu)化。以Waters Symmetry R-C18色譜柱作分析柱，設(shè)流動(dòng)相甲醇∶水為95∶5、96∶4、98∶2，測(cè)定維生素D（圖5）。

圖5 使用不同流動(dòng)相比例檢測(cè)維生素D效果

當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶水=95∶5時(shí)，峰形較好，但出峰時(shí)間較晚；當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶水=96∶4時(shí)，出峰時(shí)間比較合適，峰形較好，且相鄰峰之間影響較小。當(dāng)流動(dòng)相比例為甲醇∶水=98∶2時(shí)，峰形較差，有雙峰相連現(xiàn)象。經(jīng)對(duì)比選擇甲醇∶水=96∶4為流動(dòng)相進(jìn)行維生素D的檢測(cè)。

（3）流速的優(yōu)化。將200 μg·mL-1的維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜，調(diào)整流速為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進(jìn)行色譜分析（圖6）。當(dāng)流速為0.5 mL·min-1時(shí)，出峰很小且峰形難看；流速為1.0 mL·min-1時(shí)，峰形好看，分離情況良好；流速為1.5 mL·min-1時(shí)，峰形較好但雜質(zhì)峰很大并顯示柱壓過(guò)高。經(jīng)對(duì)比選擇1.0 mL·min-1的流速進(jìn)行維生素D檢測(cè)。

圖6 使用不同流速檢測(cè)維生素D效果

2.2 檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 維生素A檢測(cè)結(jié)果

選Agilent Eclipse XDB-C18柱為分析柱，流動(dòng)相為甲醇∶水（96∶4），流速為0.8 mL·min-1，建立維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程為y=103.478 87x-3.567 22。結(jié)果顯示維生素A在0.2～6.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以同一份樣品同天內(nèi)檢測(cè)5次，檢測(cè)結(jié)果為0.74 mg/100 g、0.75 mg/100 g、0.76 mg/100 g、0.74 mg/100 g和0.76 mg/100 g，維生素A的平均含量為0.75 mg/100 g，日內(nèi)精密度（RSD）為1.3%。

2.2.2 維生素D檢測(cè)結(jié)果

選Waters Symmetry R-C18柱分析，流動(dòng)相甲醇∶水（96∶4），流速1.0 mL·min-1，建立維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程為y=111.998 66x-63.620 36，結(jié)果顯示維生素D在1～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 5。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以同一份樣品同天內(nèi)檢測(cè)5次，結(jié)果為0.70 mg/100 g、0.68 mg/100 g、0.69 mg/100 g、0.70 mg/100 g和0.68 mg/100 g，維生素D的平均含量為0.69 mg/100 g，日內(nèi)精密度（RSD）為1%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)亞臨界萃取法制備河鲀肝油，利用HPLC法檢測(cè)魚(yú)肝油樣品中維生素A及維生素D的含量。通過(guò)對(duì)不同色譜柱、流動(dòng)相比例、流速大小的分析篩選，優(yōu)化得到最佳色譜條件，測(cè)得樣品中維生素A平均含量為0.75 mg/100 g，維生素D平均含量為0.69 mg/100 g。本方法綠色環(huán)保，簡(jiǎn)便易行，能滿(mǎn)足對(duì)魚(yú)肝油中維生素A及維生素D含量檢測(cè)的要求，并可為進(jìn)一步研究此類(lèi)功能性油脂提供參考。