高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉與保健食品中維生素B12的含量

李 蓮，林潔娜，羅雪婷

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省質量監督食品檢驗站，廣東廣州 511442）

維生素B12（VB12）是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱，化學式為CoC63H88N14O14P，溶于乙醇、甲醇以及水，pH值為4.5～5.0時較為穩定。維生素B12主要以輔酶形式參與各種代謝過程，參與某些化合物的異構化作用；促進人體中脂肪、蛋白質等物質的新陳代謝；參與制造紅細胞的產生，并加速細胞的生長發育，防止惡性貧血、老年癡呆、抑郁癥等疾病。維生素B12是人體所必需且不能自身合成的重要營養物質，人體可通過攝入動物源食品來獲取，包括魚、肉、家禽、雞蛋和牛奶等，日常補助量約2.4 μg，孕期、哺乳期的女性可提高到2.6 μg，嬰兒為0.4 μg。正常成年人對其需要量可通過合理飲食得到補充，特殊群體可攝入功能性成分食品進行補充，但不可過量，過量或可引發哮喘、濕疹等過敏反應[1-3]。

維生素B12的結構極為復雜，有5-脫氧腺苷鈷胺素、羥基鈷胺素、甲基鈷胺素、氰鈷胺素等，自然環境下，前3種物質為微生物合成VB12的最終形式，但性質不穩定，氰化鉀或氰化鈉可將天然形式的VB12轉化成更穩定的氰鈷胺素。傳統意義的VB12則是指氰鈷胺素，而氰鈷胺素通常作為食品添加劑被添加到保健食品以及嬰幼兒乳粉中，起到補充VB12的目的，但需要嚴格控制添加量。因此，高效及準確定量VB12尤為重要。經過多年探索，有關VB12的檢測方法從最初的步驟煩瑣、工作量大的微生物法發展到快速又準確的酶聯免疫法，但酶聯免疫法成本較高，因此又衍生出了包括高效液相色譜法在內的各種檢測方法，本文建立了較為快速、簡單的高效液相色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉以及保健食品中VB12含量的方法[4-5]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乳清蛋白粉，市售；B族維生素片中VB12定量分析質控樣品1，嬰幼兒奶粉中VB12定量分析質控樣品2，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；5批嬰幼兒配方奶粉[樣品1，澳優愛優（1段）；樣品2，愛他美卓（2段）；樣品3，佳貝艾特（3段）；樣品4，樂鉑（1段）；樣品5，諾優能（3段）]，市售；6批保健品（樣品1：太陽神牌B族維生素片；樣品2：欣笙禾維生素營養食品；樣品3：濟維他牌維生素B片；樣品4：白蕓豆綜合果蔬酵素粉；樣品5：電解質固體飲料；樣品6：千舒配方營養粉），市售；標準物質：VB12（CAS：68-19-9），FirstStandard公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），上海星可高純溶劑有限公司；無水乙醇（分析純），天津市康科德科科技有限公司；鹽酸（分析純）、磷酸（分析純），廣州化學試劑廠；乙酸鈉（分析純）、硫酸鋅（分析純）、乙酸鋅（分析純）、氫氧化鈉（分析純），天津福晨化學試劑有限公司；實驗中所用的水為一級水。

凈化柱：DIKMA-Proelut PLS固相萃取柱（150 mg），迪馬科技公司；高效液相色譜儀（配DAD檢測器），美國Agilent公司；AutoEVA-60型全自動平行濃縮儀，廈門睿科儀器有限公司；臺式離心機，北京博勵行儀器有限公司；超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；漩渦混合器，德國IKA公司；電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.2 標準溶液配制

準確稱取標準品10 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL，轉移棕色瓶冷凍保存6個月，其濃度為1 000 μg·mL-1。由于保健食中VB12的含量較高，可配制標準溶液濃度為0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1；而嬰幼兒配方奶粉中VB12的含量較低，可配制標準溶液濃度為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和150 ng·mL-1。標準溶液均用水配制。

1.3 試樣前處理

1.3.1 保健食品試樣前處理

（1）直接提取法。稱取已制備好的試樣2.000 g到50 mL容量瓶中，加25 mL水，渦漩2 min，用1 mol·L-1鹽酸調pH值至4.0～4.5，于40 ℃超聲30 min，加水定容。取樣液10 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.45 μm水膜，待測。此法用于檢測基質簡單的B族維生素片中VB12的含量。

（2）固相萃取法。固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL水平衡，吸取10 mL用直接提取法制備的上清液過柱，等樣液滴完，依次用5 mL水、5 mL 0.2%的磷酸溶液淋洗柱子，棄去流出液，用5 mL甲醇洗脫并收集凈化液到氮吹管中，40 ℃氮吹至干，1 mL水復溶，過0.45 μm水膜，待測。此法針對多成分、基質復雜的保健食品。

1.3.2 嬰幼兒配方奶粉試樣前處理

（1）直接提取法。稱取5.000 g樣品于250 mL錐形瓶，加40 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質塞子，高壓滅菌鍋中121 ℃保持30 min，冷卻至40 ℃以下取出，冷卻至室溫，用10 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調節pH值至4.0～4.5，轉移至50 mL容量瓶，用水定容。取樣液于10 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.45 μm水膜，待測。此法用于處理嬰幼兒配方奶粉中VB12含量高于4 μg/100 g的樣品。

（2）固相萃取法。操作過程同保健品固相萃取法一致。此法用于處理嬰幼兒配方奶粉中VB12含量低于4 μg/100 g的樣品。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-Aq反向色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：361 nm；進樣量：100 μL。流動相條件詳見表1。

表1 色譜參考條件

2 結果與分析

2.1 樣品前處理優化

2.1.1 保健品基質

（1）B族維生素片。B族維生素片成分簡單，用水、甲醇、50%甲醇、乙醇作為提取試劑進行前處理，其他過程不變，實驗中選擇3種B族維生素片以及質控樣進行處理，每個方法2個平行，處理結果見表2。結果發現，水和50%的甲醇結果較接近樣品標簽值，純甲醇不能完全提取，乙醇提取均未出峰，考慮試劑環保問題，本文選擇水作為前處理提取試劑。

表2 不同前處理方式下B族維生素片中VB12的提取結果（單位：μg·g-1）

（2）基質復雜的保健品。針對復合營養素、原料中添加較高含量碳酸鈣、明膠等的復合片及固體飲料等，水直接提取不能準確定量VB12的含量，雜峰較多，影響最大吸收光譜，而選擇固相萃取柱法進行試樣富集、凈化，可準確定量基質復雜的保健品中VB12。本文選擇3種樣品，用水提取和固相萃取柱法進行處理，結果見表3，對比發現固相萃取柱法的結果更接近樣品標簽值。

表3 不同前處理方式下基質復雜的保健品中VB12的提取結果（單位：μg·g-1）

2.1.2 幼兒配方奶粉基質

嬰幼兒配方奶粉中的蛋白質對VB12的測定結果有較大影響，故沉淀蛋白是最重要的環節。本文分別選擇加入5 mL 0.5 mol·L-1乙酸鈉溶液、0.5 mol·L-1乙酸鋅溶液、0.5 mol·L-1硫酸鋅溶液、乙醇溶液，以及在高壓滅菌鍋中121 ℃保持30 min，結果顯示添加溶液沉淀蛋白的效果不理想，離心后未澄清；而高壓滅菌后離心，樣液完全澄清，但嬰幼兒配方奶粉中VB12含量特別低，以此進行前處理（不加溶液直接高壓滅菌），樣品濃度在5～10 ng·mL-1，很考驗普通紫外檢測器，含量低于4 μg/100 g的樣品，不易準確定量，而選擇固相萃取法可將樣品濃度提高至50～150 ng·mL-1，適用于長期檢測，方法穩定性好。

本文選取了5批嬰幼兒奶粉以及質控樣，按上述過程進行處理，每個試樣平行兩份，結果如表4所示。VB12含量低于2 μg/100 g的樣品用水直接提取，結果為未檢出，而使用固相萃取法，回收率可達90%。圖1、圖2為奶粉基質的兩種前處理方式的色譜圖，直接提取的樣品響應較低，雜峰較多，固相萃取法樣品峰形完美。

圖1 奶粉基質直提方式VB12出峰情況

圖2 奶粉基質固相萃取方式VB12出峰情況

表4 不同前處理方式下嬰幼兒奶粉中VB12的提取結果（單位：μg/100 g）

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

選擇實驗室現有的SB-C18、SB-Aq以及AQC183種類型的反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），通過多次調整以及參考國標法[6-7]確認最適合的色譜條件，具體出峰情況及相關信息詳見表5。分析可知，選擇SB-Aq色譜柱以及0.025%三氟乙酸-乙腈進行梯度洗脫，兩個基質均出峰，且耗時較短。

表5 色譜條件的優化方式

2.2.2 檢測波長的選擇

用濃度為1 μg·mL-1的VB12標準溶液，用DAD檢測器3D通道掃描，測定最大吸收光譜，波長掃描范圍為200～600 nm。如圖3所示，VB12在361 nm處有較大吸收峰，出峰情況良好，因此本文兩種基質均選擇361 nm作為檢測波長。

圖3 VB12標準溶液的吸收光譜

2.2.3 流速與柱溫的選擇

實驗中選擇0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-13個常用流速作為參考，其他條件不變。比較發現，流速為0.5 mL·min-1時不能出峰，0.8 mL·min-1時出峰相對較慢，峰形對稱性不佳，柱效較差，1.0 mL·min-1時的圖譜見圖1、2，出峰時間與峰形相對適宜，故本文選擇流速1.0 mL·min-1。

本文研究了柱溫（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）對保健品和乳粉中VB12檢測效果的影響。結果發現，溫度較低時，目標峰與雜質峰的分離度不好，有拖尾出現；50 ℃時目標物峰面積會減小；綜合考慮，選擇柱溫40 ℃可滿足保健品和乳粉中VB12的檢測。

2.3 線性范圍、檢出限、回收率、精密度

以VB12濃度為橫坐標（x），對應的峰面積為縱坐標（y），分析標準溶液濃度線性關系，保健品的線性方程為y=38.46x+8.978 7，r2=0.999 6；嬰幼兒奶粉的線性方程為y=0.085 7x+0.230 5，r2=0.999 3，線性良好。由于保健品中VB12含量較高，因此本文選擇嬰幼兒奶粉基質來確定儀器檢出限，當信噪比S/N=3時，基線噪音為0.020 mAU，樣品峰高為0.060 mAU，對應樣品濃度為4 ng·mL-1，因此檢出限為0.4 μg/100 g。

對于加標回收實驗，保健品使用了實驗室現有的不含有VB12的固體飲料，乳粉選擇了乳清蛋白粉進行加標，按表6中3個水平加標，平行6份，按照固相萃取柱的方法進行前處理。由表6可知，保健品的VB12加標回收率在87.9%～96.0%，RSD在1.5%～1.8%；乳粉的VB12加標回收率在86.2%～95.3%，RSD在1.3%～1.7%，均符合GB/T 27404——2008[8]附錄F中回收率和精密度的要求，表明該方法的準確度和精密度良好，可滿足實驗需求。

表6 VB12加標回收率實驗結果（n=6）

3 結論

本文建立了高效液相色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉與保健品中VB12的分析方法，樣品前處理根據基質的性質選擇了直接提取法與固相萃取法，得出VB12標準溶液線性良好，r2＞0.999，檢出限為0.4 μg/100 g，檢測結果與樣品標示值較為接近，整個實驗過程花費時間較少。表明該方法簡便快捷、成本低、結果準確。