對微生物污染引起的食物中毒檢驗檢測分析

冉 艷，張運依

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州貴陽 550014）

食物中毒屬于日常生活中十分常見的中毒性疾病，為攝入被微生物、化學性有毒有害物質污染過的食物所致[1]。目前臨床研究指出，食物中毒多急性起病或者是亞急性起病，類型包括細菌性食物中毒、化學性食物中毒、動物性食物中毒、植物性食物中毒、真菌性食物中毒5種且在炎炎夏日更為多見[2]。微生物污染是誘發(fā)食物中毒的主要致病菌且種類多樣，明確具體的致病菌類型并予以針對性的治療成為降低死亡率的關鍵。選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定與聚合酶鏈反應快速檢測為微生物污染引起的食物中毒常用的檢測方法，對二者檢驗結果進行對比可以為檢驗工作的合理選用提供指導，且總結主要致病菌類型以及高發(fā)季節(jié)有助于預防食物中毒的發(fā)生。本研究對此展開研究，內容如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月——2022年12月采集到的100例微生物污染引起的食物中毒患者樣本，其中男性患者52例、女性患者48例；患者年齡：24歲～67歲，平均年齡（45.64±10.23）歲；樣本類型：糞便54例、嘔吐物35例、食物11例。納入標準：①所有患者均確診為食物中毒；②知曉研究方案具體內容且同意參與者。排除標準：①同一例患者的重復采集樣本；②化學性食物中毒、動物性食物中毒、植物性食物中毒、真菌性食物中毒者。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，法國梅里埃公司；FYL-YS-50LK恒溫孵育箱，北京福意聯(lián)醫(yī)療設備有限公司；微生物培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

病原菌顯色平板，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；細菌通用PCR試劑盒，上海雅吉生物科技有限公司；結晶紫染液、95%酒精，南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集與檢測

（1）樣本采集方法。在食物中毒發(fā)生后檢驗人員迅速穿戴好防護用具，嚴格按照無菌操作規(guī)范內容進行樣本采集，利用75%酒精棉球對手部進行徹底的消毒或佩戴醫(yī)用無菌手套。使用的樣本采集容器均經(jīng)過高壓滅菌處理，鑷子等醫(yī)療用物在使用前置于酒精燈火焰上灼燒。樣本具體采集方法如下：①采集嘔吐物時選取沒有混入雜質的新鮮樣本，獲得足夠樣本量后轉移至無菌容器中；②采集殘余食物時利用酒精燈灼燒過的鑷子輕輕夾取待檢測的樣本并轉移至無菌容器中；③采集糞便時收集新鮮的糞便3～5 g并轉移至干燥清潔滅菌的專用容器中，盡量在采集后1 h內送檢。如果無法在規(guī)定的時間內送檢，則將采集到的樣本置于-20 ℃冰箱中暫存待檢。

（2）樣本檢測方法。①選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定。將所有待檢測樣本分別接種至副溶血性弧菌顯色平板、大腸桿菌顯色平板、沙門氏菌顯色平板、金黃色葡萄球菌顯色平板、志賀菌顯色平板、變形桿菌顯色平板、蠟樣芽孢桿菌顯色平板。置于恒溫孵育箱中37 ℃下孵育24 h。從各個顯色平板中挑選優(yōu)勢菌落并接種在微生物培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂平板）中，微生物培養(yǎng)基與致病菌類型相對應。選取潔凈的載玻片并刻畫一個直徑1.5 cm的圓環(huán)，滴入1滴生理鹽水滅菌處理。將待檢測樣本中的菌落與生理鹽水相混勻形成混濁溶液，菌膜大小以1 cm為宜。室溫條件下自然風干，利用火焰加熱法固定細菌，將結晶紫染液滴在涂片上，60 s后流動自來水沖洗干凈，去除殘留的水分后加入盧戈碘液，60 s后流動自來水沖洗干凈，去除殘留的水分。加入數(shù)滴的95%酒精并適度搖晃涂片使其均勻脫色。斜持涂片并再次滴加酒精直至酒精無色，流動自來水沖洗干凈，去除殘余水分。加稀釋石炭酸復紅染30 s，流動自來水沖洗并去除殘余水分。涂片中滴加香柏油并在油鏡下觀察，染色為紫色時判定為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌。利用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對具體致病菌類型進行鑒定。②聚合酶鏈式反應快速檢測。利用生理鹽水對收集到的樣本進行處理，采用細菌通用PCR試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒內說明書內容執(zhí)行操作。待檢測樣本的Ct值≥34為陰性，Ct值≤30為陽性，在30～34視為可疑樣本，重復檢測1次后Ct值＜34且擴增曲線有明顯起峰為陽性，反之為陰性[3]。

1.3.2 觀察指標

（1）微生物類型及占比。微生物類型及占比包括副溶血性弧菌及占比、大腸桿菌及占比、沙門氏菌及占比、金黃色葡萄球菌及占比、志賀菌及占比、變形桿菌及占比、蠟樣芽孢桿菌及占比，占比為相應致病菌例數(shù)/樣本總例數(shù)×100.00%。

（2）食物中毒季節(jié)分布。食物中毒季節(jié)分布包括春季及占比、夏季及占比、秋季及占比、冬季及占比，占比為相應季節(jié)食物中毒例數(shù)/樣本總例數(shù)×100.00%。

（3）總檢出率。總檢出率為副溶血性弧菌檢出率、大腸桿菌檢出率、沙門氏菌檢出率、金黃色葡萄球菌檢出率、志賀菌檢出率、變形桿菌檢出率、蠟樣芽孢桿菌檢出率的綜合。

1.3.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 微生物類型及占比比較

100例微生物污染引起的食物中毒患者樣本中副溶血性弧菌占比顯著高于其他致病菌占比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明微生物污染引起的食物中毒事件中副溶血性弧菌為主要的微生物類型，見表1。

表1 微生物類型及占比比較

2.2 食物中毒季節(jié)分布比較

食物中毒季節(jié)分布中夏季最高、冬季最低，春季和秋季介于二者之間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明微生物污染引起的食物中毒事件夏季高發(fā)，春季和秋季次之，冬季少見，見表2。

表2 食物中毒季節(jié)分布比較

2.3 不同檢測方法的總檢出率比較

PCR快速檢測的總檢出率高于選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同檢測方法的總檢出率比較

3 結論與討論

本研究圍繞100例微生物污染引起的食物中毒患者樣本展開分析后證實，副溶血性弧菌為此次食物中毒的主要致病菌，其次為大腸桿菌、沙門氏菌，蠟樣芽孢桿菌的占比最低。副溶血性弧菌屬于弧菌科革蘭氏陰性桿菌，為嗜鹽性海洋細菌，主要源于海鮮和海產品，也是我國沿海地區(qū)食物中毒的主要食源性致病菌[4-7]。大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，能夠產酸、產氣且進入腸道中可以迅速、大量繁殖，多在糞便樣本中檢出。沙門氏菌為一大類形態(tài)、生化性狀、抗原構造相似的革蘭氏陰性桿菌所組成，35～37 ℃將會快速增殖[8]。

在季節(jié)分布上夏季最高、冬季最低，春季和秋季介于二者之間，表明夏季為微生物污染引起的食物中毒的高發(fā)季節(jié)。原因在于夏季的氣溫高、濕度大，為各種致病微生物的生長繁殖提供了便利的條件。同時食物在夏季時非常容易腐敗，加之蒼蠅叮爬也會造成食物污染，而人們一旦攝入被微生物污染的食物，發(fā)生食物中毒的風險隨之提高。

微生物污染引起的食物中毒檢測方法以選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定、PCR快速檢測為主，在本研究中PCR快速檢測的總檢出率高于選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定，表明PCR快速檢測的應用價值更高。原因在于選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定雖然具有操作簡便、檢測時間短的優(yōu)勢，但漏檢率處于較高水平，此點對臨床治療帶來了一定的不便。PCR快速檢測使用的細菌通用PCR試劑盒已經(jīng)商品化，在質控方面得到了有力的保障。同時檢測方法流程化、規(guī)范化，使其檢測結果的準確性更高，但其不足在于檢測費用較為高昂，所以在應用中需要根據(jù)當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展水平、檢驗機構實際情況合理選用。

綜上所述，微生物污染引起的食物中毒以副溶血性弧菌最為常見且夏季高發(fā)，PCR快速檢測的結果較選擇性平板直接分離培養(yǎng)鑒定更為可靠。