嬰幼兒配方乳粉中核苷酸含量檢測條件優化研究

謝繼輝

（安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051）

核苷酸是由含氮雜環堿基、五碳糖和磷酸基團組成的一類化合物。生物的遺傳信息存儲于DNA和RNA中，而核苷酸是DNA和RNA的合成前體。此外，核苷酸還具有代謝調節、組成輔酶、參與糖原和糖蛋白的合成過程。遺傳信息傳遞成功，對人類生命活動極其重要。研究表明，喂養強化核苷酸配方奶粉的嬰幼兒在體重、身長、頭圍、腸道耐受性等指標上，與母乳喂養的嬰幼兒數據更為接近。另有研究顯示核苷酸還具有降低腹瀉的風險和發生率、提高免疫力、改善腸道微生態、改善嬰兒血脂組成、增強嬰幼兒對疫苗的反應等功能。

由于核苷酸可在人體內合成，對于成年人來說無需專門補充核苷酸。但嬰幼兒身體生長速度快，身體合成機能發育還不完善，故其體內核苷酸的合成速度不能滿足其生長的需求。目前，嬰幼兒配方奶粉多以牛乳、羊乳為原料制成。牛乳和羊乳中核苷酸的濃度和種類與人類母乳有明顯差異。母乳是嬰兒的最佳食物，含有較高濃度的核苷酸，為使嬰幼兒配方奶粉盡可能地接近母乳，需要在其中額外添加核苷酸。自1965年起，日本、歐盟、美國先后允許將核苷酸添加在嬰幼兒配方食品當中。《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》（GB 14880——2012）[1]規定，核苷酸作為營養強化劑，可被用于嬰幼兒配方食品，含量范圍為0.12～0.58 g·kg-1（以核苷酸總量計）。嬰幼兒乳粉中通常使用的核苷酸有5種，分別是胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）和腺嘌呤核苷酸（AMP）。目前在中國的市場上，半數以上的嬰幼兒配方奶粉的產品的營養成分表上都標示添加了核苷酸。

由于嬰幼兒配方奶粉的質量關乎下一代的健康成長，我國市場監管部門在每年的食品抽檢中對其非常重視，所抽檢的樣品要按照抽樣細則指定方法按營養成分表逐項檢驗。文獻報道的核苷酸檢測方法有離子色譜法[2]、毛細管電泳法、液相色譜法[3-5]、液相色譜-質譜法[6]等，但在近年的食品抽檢中，嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量的測定指定的檢驗方法是《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》（GB 5413.40——2016）[7-9]。該方法的原理是用水提取樣品，調節pH值沉淀蛋白質后，借助高效液相色譜儀檢測。然而，在實際的檢測過程中，往往發現用該方法得出的數據遠高于實際值，其原因是色譜分析中有雜質沒有被完全分離，導致檢出值偏高。故本研究主要考察影響分離效果的主要因素，以優化此方法，使得檢驗數據更準確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP），上海安譜；質控樣品：QCIP-714嬰兒配方乳粉中核苷酸定量分析質控樣品，中國檢驗檢疫科學研究院；冰乙酸、磷酸氫二鉀，國藥；四丁基硫酸氫銨，MACKLIN。

高效液相色譜儀，島津LC-20AD，配二極管陣列檢測器SPD-M20A，工作站軟件LabSolutions；純水機，ELGA GLXXXDIM2；電子天平，METTLER TOLEDO XSE204；pH計，METTLER TOLEDO S220。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

①標準溶液配制。核苷酸標準品CMP、AMP、UMP各稱取10 mg，GMP和IMP各稱取5 mg，用純水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用水定容。此標準溶液濃度為CMP、AMP、UMP各100 μg·mL-1；GMP、IMP各50 μg·mL-1。分別吸取此混合溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL，加超純水定容至50 mL，此為核苷酸系列標準工作液。②磷酸鹽緩沖液。稱取1.36 g磷酸二氫鉀，0.475 3 g四丁基硫酸氫銨，加入接近1 L的純水溶解，用磷酸氫二鉀溶液精細調節pH值至3.2，用水定容到1 000 mL。

1.2.2 樣品處理

稱取奶粉試樣5 g于錐形瓶中，加入20 mL溫水（50～60 ℃）充分溶解，冷卻至室溫后用醋酸溶液調試樣溶液至pH=4.1，移入50 mL容量瓶中，定容，濾紙過濾，所得濾液用0.45 μm濾膜過濾備用。

1.2.3 單因素試驗設計

（1）改變流動相中有機相比例對分離效果的影響。取樣品乳粉按1.2.2處理后，使用液相色譜檢測，色譜條件依照1.2.4設置，使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相pH值按照《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》（GB 5413.40——2016）規定調節至pH=3.20左右。僅改變流動相中甲醇含量，分別以甲醇1%、3%、7%和10%的不同比例進行檢測。通過工作站軟件LabSolutions計算目標峰分離度。

（2）流動相pH值對分離效果的影響。樣品乳粉按1.2.2處理后，使用液相色譜檢測，色譜條件依照1.2.4設置，僅改變流動相中磷酸鹽緩沖液的pH值。按照標準規定配制磷酸鹽緩沖液，之后用磷酸和磷酸氫二鉀調節pH值至2.9、3.0、3.1、3.2和3.3左右。流動相中甲醇設置為4%。更換流動相后充分平衡后再進樣。

（3）不同色譜柱分離效果研究。樣品乳粉按1.2.2處理后，分別使用不同型號色譜柱，并調節流動相pH值至2.9、3.0、3.1、3.2、3.3左右進行檢測分析。尋找最佳分離條件。

1.2.4 色譜條件

流動相水相：磷酸鹽緩沖液；流動相有機相：甲醇；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL。

2 結果與分析

2.1 改變流動相中甲醇含量對分離效果的影響分析

一般來說，目標峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5，被認為分離效果較好。本實驗中，使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，流動相pH值調節至3.241的情況下，UMP與GMP的分離效果不佳，即GMP的分離度明顯小于1.5。且改變流動相中甲醇比例后，目標峰和雜質峰出峰時間變化基本同步，不能提高分離效果，見表1。

表1 流動相中不同甲醇含量下目標峰分離度

2.2 流動相pH值對分離效果的影響分析

由圖1可知，當流動相pH=3.126時，AMP與雜質峰融合，不能分離，導致AMP檢出值偏高。圖2為流動相pH=3.011時圖譜，可見AMP出峰時間提前，與雜質峰分離。但GMP與IMP之間有一雜質峰，對比圖1與圖2可發現，如pH值更低，該雜質峰將與IMP融合，導致IMP檢出值偏高。反之，如pH值增加，該雜質峰可能與GMP融合，也會導致檢出值偏高。其原因是當pH值較高時，各核苷酸出峰時間均會延后，但延后程度各不相同，其中腺嘌呤核苷酸（AMP）出峰時間變化其他核苷酸更為明顯。利用這種規律可找到各核苷酸能夠正好分離的流動相pH條件。

圖1 流動相pH=3.126時色譜圖

圖2 流動相pH=3.011時色譜圖

表2為使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，在不同流動相pH值下的質控樣品回收率，此結果顯示最佳pH條件在3.0左右，而且pH值僅僅改變0.1都可能對結果產生較大影響。實驗中也發現，因流動相pH值對實驗結果影響很大，所以檢驗前平衡色譜柱需要花費很長時間。且流動相在配制時需要特別注意，要待試劑溶解充分后再調節pH值。進樣時要注意儀器的使用環境，避免晝夜溫差過大使流動相pH值產生變化。

表2 不同pH值流動相下質控樣品回收率

2.3 色譜柱對分離效果的分析

使用不同色譜柱，在不同pH值流動相條件下對同一樣品的分析結果顯示，不同色譜柱的分離效果有明顯不同，不同色譜柱對應的流動相最佳pH值也不同。每種色譜柱表現最好的pH值和對應回收率見表3。從結果看，一般常用色譜柱，如果找到合適的pH值（多在3.0左右），都可以把回收率控制在110%以內，可以認為滿足正常檢驗需求。但不同色譜柱對本實驗中流動相條件（低pH值、高水相、含表面活性劑）的耐受性不同，實驗中發現有些色譜柱表現不穩定，運行時間稍長即出現出峰時間變化，分離度降低等現象。

表3 不同色譜柱的最佳pH值和回收率

3 結論與討論

從實驗結果看，嬰幼兒配方奶粉中核苷酸的分離中最大的影響因素是流動相的pH值、其次是色譜柱的選擇以及兩者的匹配。《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》（GB 5413.40——2016）標準中推薦的流動相pH=3.20略高，檢測時可以根據本實驗具體條件調低一些。同理，也可以把pH值調高，pH值調高后，AMP出峰時間相比其他4個核苷酸延后更明顯，也可以達到分離效果。但此條件下核苷酸出峰時間延后，色譜時間太長。通常為縮短色譜時間，可采用梯度洗脫，但核苷酸對色譜條件極為敏感，即使采用梯度洗脫，還是需要一個相當長的平衡時間，否則重現性不好。故綜合看來，低pH值分離最為合適。建議在首次開展檢測時，對選定的色譜柱，從pH=2.9～3.0開始摸索最適合的色譜條件。

本方法中流動相含離子對試劑，流動相pH值比較低，有機相含量也很低，這種條件對色譜柱傷害較大，使用幾次后，色譜柱柱效就會明顯下降，這也是分離效果差的一個常見原因。