分光光度法測定醬油種曲的孢子數

李興周，劉建華，李遠珍，黃佳玲

（廣東廚邦食品有限公司，廣東陽江 529500）

醬油釀造主要包括醬油種曲培養、大曲培養、曬場發酵三大過程，其釀造的第一步是生產優良的種曲，即米曲霉的擴大培養物，它要求孢子健壯、數量多[1]。種曲孢子數是衡量種曲質量的一個重要指標，要求孢子數大于90億個/g干基[2]。目前，醬油種曲孢子數的檢測方法主要參照《孢子數測定法》（SB/T 10315——1999），即血球計數法。在計測孢子數的實際操作中，需先對樣品進行稀釋、再取其稀釋液制片、而后鏡檢計數，其中制片后往往需靜置2～3 min使孢子沉降再鏡檢計數，單個樣品鏡檢計數時間約10～15 min，且需鏡檢計數2次以上，再取其平均值作為檢測結果，因此單個樣品制片與鏡檢計數約需30 min，該檢測方法費時費力且2次鏡檢計數結果偏差較大。

有少量文獻報道采用光電比濁法測定頂頭孢霉菌、黑曲霉、白地霉和康寧木霉孢子數，該方法具有簡單、快速、準確的特點[3-4]。本實驗嘗試采用分光光度法對醬油種曲的孢子數進行測定，且與上述血球計數法進行對比分析，以達到用分光光度法替代血球計數法，為醬油種曲孢子的計數提供一種簡單、快速、準確的測定方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

醬油種曲（米曲霉），由廣東廚邦食品有限公司提供。

乙醇（95%），分析純，廣東廣試試劑科技有限公司；稀硫酸，自配，濃硫酸與水按體積比1∶9混合均勻即可。

1.2 儀器與設備

IKA RH磁力攪拌器，廣州綠百草科學儀器有限公司；25×16血球計數板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；T6新銳可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準樣液的制備

（1）稱樣。稱取成熟醬油種曲（黃綠色、孢子多）（1±0.001） g，置于250 mL三角瓶內。

（2）孢子分散。向三角瓶內加入10 mL 95%乙醇、20 mL純水及10 mL稀硫酸，再加入一小勺的玻璃珠和1顆攪拌子，置于磁力攪拌器電磁板上攪拌，以1 000 r·min-1的轉速攪拌30 min，使孢子個個分散。

（3）過濾定容。將分散后的樣品使用100目紗布過濾至500 mL容量瓶中，采用純水沖洗曲渣，務使濾渣不含孢子，再定容，倒置搖勻獲得標準樣液（每次使用/計數前需先將容量瓶上下顛倒10次搖勻）。

（4）標準樣液計數。使用1 mL刻度吸管吸取1 mL標準樣液，用濾紙擦干吸管外表面的余液，使標準樣液從吸管中勻速滴出，取中間2滴于血球計數板的兩個計數室上，再將蓋片輕輕由一邊向另一邊壓下，使蓋片與計數板完全密合、液中無氣泡，靜置3 min，待孢子自然沉降后使用顯微鏡鏡檢計數，最后計算結果。做3次重復標準樣液計數，取平均值作為標準樣液對應醬油種曲的濕基孢子數[5]。

1.3.2 標準曲線的繪制

用移液管分別移取標準樣液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL和50 mL于50 mL容量瓶中，用純水稀釋至刻度，搖勻，以95%乙醇∶稀硫酸∶純水=1∶1∶48的混合液為參比，在480 nm處用可見分光光度計測定其吸光度（每次測定前需將容量瓶中溶液上下顛倒10次搖勻，每個稀釋度檢測3次取平均值），以醬油種曲的濕基孢子數為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 醬油種曲干基孢子數的測定

（1）稱樣。同1.3.1稱樣中的操作。

（2）孢子分散。同1.3.1孢子分散中的操作。

（3）過濾定容。將分散后的樣品使用100目紗布過濾至1 000 mL容量瓶中，采用純水沖洗曲渣，務使濾渣不含孢子，再定容，倒置搖勻，即得樣品測試液（每次測定前需先將容量瓶上下顛倒10次搖勻）。

（4）樣品測定。取適量的樣品測試液至比色皿中，參照“1.3.2”項下方法在480 nm處測定吸光度，計算測定結果。

（5）醬油種曲干基孢子數的計算。計算公式為

其中，醬油種曲水分含量的檢測參照《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3——2016）[6]。

1.3.4 精密度實驗

取適量1.3.3方法中的樣品測試液至比色皿中，在波長480 nm處測定吸光度，連續測定6次，計算結果。

1.3.5 重復性實驗

取同批次醬油種曲樣品，按照1.3.3（1）～（3）中的操作方法平行制備5份樣品測試液，參照“1.3.2”項下方法在480 nm處測定吸光度，計算測定結果。

1.3.6 方法對比

隨機選取醬油種曲1#、醬油種曲2#、醬油種曲3#、醬油種曲4#、醬油種曲5#和醬油種曲6#共6批次成熟種曲作為實驗樣品，由2名操作熟練的檢測人員各對3批次樣品分別采用本法與血球計數法（參照1.3.1項下操作方法）進行孢子數測定，每個樣品測定/計數2次，計算其干基孢子數，對比同一方法2次測定結果與同一樣品兩種方法的測定結果，從而分析確定分光光度法能否替代血球計數法測定醬油種曲的孢子數。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察結果

按照1.3.2的方法進行考察，以醬油種曲的濕基孢子數為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線，曲線回歸方程為y=93.70x-1.53，線性相關系數R2=0.998 8，其擬合程度高。由圖1可知，該方法測定醬油種曲的濕基孢子數在14～72億個/g線性關系良好。

圖1 濕基孢子數與吸光度的關系

2.2 精密度考察結果

按照1.3.4方法進行精密度考察，測定6次吸光度分別為0.353、0.348、0.359、0.351、0.345和0.356，平均吸光度為0.352，6次測定的相對標準偏差RSD為1.62%，表明該方法測定結果的精密度良好。

2.3 重復性考察結果

按照1.3.5方法進行重復性考察，該同批次醬油種曲樣品的干基孢子數分別為122.75億個/g、118.89億個/g、120.67億個/g、118.29億個/g、116.80億個/g，平均干基孢子數為119.48億個/g，相對標準偏差RSD為1.92%。結果表明，本實驗方法的測定結果重復性高、方法穩定（表1）。

表1 重復性實驗結果

2.4 方法對比結果

不同分析方法間測定結果的比較，用于判斷兩方法間一致性，是檢測實驗室經常遇到的實際問題。新方法與經典方法間的比較，特別是在缺少標準樣品，不滿足t值檢驗的數據條件下，選用合適判據尤其重要。可考慮采用每組樣品分別用兩種方法測量一次，取兩方法測定結果相對偏差，與實驗室間相關偏差限值進行比較，用合格率大小判斷兩方法結果一致性程度[7]。本實驗分別采用血球計數法與本法對醬油種曲1～6#的干基孢子數進行測定，計算同一方法2次測定結果與同一樣品兩種方法測定結果的相對偏差，結合醬油種曲干基孢子數測定結果相對偏差≤15%的控制要求計算相對偏差合格率，其結果如表2所示。

表2 方法對比實驗結果

由表2可知，采用血球計數法測定醬油種曲干基孢子數，同一實驗樣品2次測定結果的相對偏差在1.51%～12.31%，平均相對偏差為7.06%，相對偏差合格率100%；采用分光光度法測定醬油種曲干基孢子數，同一實驗樣品2次測定結果的相對偏差在0%～4.02%，平均相對偏差為1.41%，相對偏差合格率100%，本法的相對偏差整體明顯低于血球計數法，相比更加穩定、準確。同時，以兩種方法2次測定結果的均值作為各自測定結果，考察兩種方法間測定結果的一致性，其方法間的相對偏差在2.29%～11.27%，方法間平均相對偏差為6.32%，方法間相對偏差合格率100%。結果表明，兩種方法測定結果的相對偏差符合醬油種曲孢子數檢測控制要求，分光光度法能夠替代血球計數法用于測定醬油種曲的孢子數。

3 結論

目前，對醬油種曲孢子數測定的研究較少，一般均采用血球計數法，本實驗對比了血球計數法與分光光度法測定醬油種曲的孢子數，從實驗可發現，血球計數法與分光光度法測定醬油種曲的孢子數均符合醬油種曲孢子數檢測控制及方法學的要求。通過本實驗研究表明，在14～72億個/g醬油種曲濕基孢子數與吸光度線性關系良好，以標準曲線法測定時，精密度實驗RSD為1.62%，重復性實驗RSD為1.92%，與血球計數法的相對偏差合格率為100%，該方法可靠、準確穩定。同時，本實驗采用分光光度法，直接使用處理好的孢子液測定吸光度即可，替代了血球計數法的制片與鏡檢計數操作，單個樣品計數環節的檢測時間可控制在1 min以內完成，檢測效率較原方法提高了96.7%。由此可見，分光光度法可替代血球計數法，在生產中為醬油種曲孢子的計數提供一種簡單、快速、準確的方法，具有廣泛應用的價值，可為其他真菌孢子的計數研究提供參考。

當然，本實驗還有一些不足的地方，本實驗針對兩種方法測定結果的一致性判斷對比方法、樣本量等還有完善空間，未考察不同培養工藝、不同出發菌株所得醬油種曲線性關系是否一致等，出發菌株、培養時間等不同均可能會對本方法產生一定影響，這些問題仍需在今后實驗技術中不斷研究改進。