GnT-IVa對(duì)京尼平苷調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞GLUT2糖基化及葡萄糖攝取的影響

李維釗,申甚莉,邊陽萍,趙婉均,汪 夏,殷 菲

(1.重慶理工大學(xué) 藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400054; 2.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 重慶 400054)

0 引言

2型糖尿病的主要特征是持續(xù)高血糖和胰島素抵抗,維持血糖水平對(duì)2型糖尿病的防治至關(guān)重要。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (glucose transporter,GLUT)介導(dǎo),GLUT的分布和功能在不同組織中存在很大差異。GLUT2是GLUT的家族成員,主要在胰島β細(xì)胞、肝、腎、腦和腸中表達(dá)[1]。GLUT2作為一種糖基化蛋白,是嚙齒動(dòng)物胰腺β細(xì)胞中的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也是葡萄糖吸收所必需的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。GLUT2可以感受細(xì)胞外微環(huán)境變化,使細(xì)胞內(nèi)、外的葡萄糖水平達(dá)到快速平衡[2]。在糖尿病動(dòng)物模型中,GLUT2表達(dá)的下調(diào)常伴隨著葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS) 障礙[3-4],但是,在胰島β細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因重新表達(dá)GLUT2可以恢復(fù)GLUT2缺失小鼠胰島素分泌能力[5]。這表明,胰島β細(xì)胞表面的GLUT2可通過調(diào)節(jié)GSIS在維持飲食攝入所致血糖動(dòng)態(tài)平衡中起關(guān)鍵作用。

已有大量研究結(jié)果證實(shí),糖基轉(zhuǎn)移酶家族在細(xì)胞內(nèi)蛋白的反應(yīng)后修飾過程中起重要作用,其中糖基轉(zhuǎn)移酶III (glycosyltransferase III,GnT-III)和GnT-V與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。GnT-IV可以通過催化GlcNAc殘基將其轉(zhuǎn)移到N-糖鏈核心的α-1,3甘露糖上,形成β-1,4分支結(jié)構(gòu)[7]。雖然GnT-IVa和GnT-IVb都屬于糖基轉(zhuǎn)移酶IV,是一對(duì)同工酶,但GnT-IVa比GnT-IVb具有更高的親和力,在組織中的表達(dá)更具特異性[8]。數(shù)據(jù)庫PhosphoSitePlus分析結(jié)果顯示,GnT-IVa在胰腺中高度表達(dá),且與2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。已有研究報(bào)道,當(dāng)小鼠GnT-IVa受損時(shí),會(huì)導(dǎo)致高血糖癥、葡萄糖耐量異常和胰島素分泌不足。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這是由胰腺β細(xì)胞關(guān)鍵葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2的功能障礙引起的。GLUT2的N-聚糖被GnT-IVa修飾后,可通過促進(jìn)GLUT2與半乳凝集素形成分支結(jié)構(gòu),提高GLUT2在細(xì)胞膜上的駐留時(shí)間,促進(jìn)葡萄糖吸收,降低血糖。在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中,由于高脂食物誘導(dǎo)GnT-IVa的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白A2 (Forkhead Box A2,FOXA2)表達(dá)異常,導(dǎo)致GnT-IVa表達(dá)下調(diào),進(jìn)而影響GLUT2的糖基化和在細(xì)胞膜上的分布,并最終影響葡萄糖的吸收和代謝。與此同時(shí),通過對(duì)2型糖尿病患者的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GnT-IVa的表達(dá)顯著降低[9-10]。這些研究結(jié)果表明,GnT-IVa在葡萄糖吸收、代謝和2型糖尿病的形成發(fā)展過程中可能具有十分重要的作用。

通過已有研究發(fā)現(xiàn):在原代大鼠胰島β細(xì)胞和INS-1大鼠胰島β細(xì)胞中,京尼平苷可以快速促進(jìn)低、中糖 (5 mmol/L和11 mmol/L)培養(yǎng)條件下的胰島β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收、代謝和葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌;然而,在高糖(25 mmol/L)培養(yǎng)條件下,京尼平苷發(fā)揮相反的作用,不僅抑制葡萄糖的吸收和代謝,還減少胰島素分泌[11-15]。最近的研究證實(shí),京尼平苷可快速調(diào)節(jié)GLUT2糖基化和蛋白糖基化關(guān)鍵分子GlcNAcT-IVa糖基化轉(zhuǎn)移酶 (GlcNAcT- IVa glycosyl-transferase,GnT-IVa)表達(dá)。但是,GnT-IVa是否與京尼平苷調(diào)節(jié)GLUT2糖基化、胰腺β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收、代謝和GSIS有直接聯(lián)系,還需進(jìn)一步研究。

首先用siRNA干擾的方法敲低INS-1細(xì)胞中GnT-IVa基因表達(dá)水平,然后考察京尼平苷對(duì)干擾后INS-1細(xì)胞中GLUT2糖基化、葡萄糖吸收、代謝和胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用,以確定京尼平苷的調(diào)節(jié)作用是否與GnT-IVa有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:GnT-IVa基因干擾后,京尼平苷對(duì)GLUT2糖基化的調(diào)節(jié)作用減弱,GLUT2在細(xì)胞膜上的分布減少,且對(duì)胰腺β細(xì)胞葡萄糖吸收、ATP生成和GSIS產(chǎn)生了影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

京尼平苷粉末購自中國食品藥品檢定研究院;PIMR細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司;GnT-IVa抗體購自Cell Signaling Technology公司;GLUT2抗體購自Proteintech Group公司;Opti-MEM 購自Invitrogen公司;β-actin抗體山羊抗小鼠IgG (H+L)、山羊抗兔IgG (H+L)購自中杉金橋;BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;ECL發(fā)光液購自新賽美生物技術(shù)公司;EndoFectinTM-Max轉(zhuǎn)染試劑購自GeneCopeoia公司;葡萄糖檢測(cè)試劑盒購自士鋒生物有限公司;胞漿胞膜分離提取試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;大鼠胰島素檢測(cè)試劑盒購自伊艾博(武漢)科技有限公司;酶標(biāo)儀購自Tecan公司;倒置顯微鏡購自日本尼康公司;GEAI600凝膠成像系統(tǒng)購自美國通用電氣公司;電泳儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用INS-1細(xì)胞購自中國典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心。其正常培養(yǎng)基為:葡萄糖濃度為11 mmol/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基 (含10%的胎牛血清,10 mmol/L HEPES,2 mmol/L L-谷氨酰胺,1 mmol/L丙酮酸鈉,50 μmol/L的巰基乙醇,100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素),培養(yǎng)條件為37 ℃,在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 GnT-IVa基因干擾

將INS-1細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)過夜,將細(xì)胞用PBS漂洗1次,換成無血清培養(yǎng)基,根據(jù)供應(yīng)商的建議將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000與Mgat4a (GnT-IVa編碼基因)的siRNA按比例混合后,靜置15 min,加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用蛋白免疫印跡檢測(cè)基因干擾效率。

GnT-IVa (編碼基因?yàn)镸gat4a)的siRNAs核苷酸序列如下:

siGnT-IVa-1:CUUACCCUGUCCUGGUAU; siGnT-IVa-2:GCUCAGGAGAAGGGC AUUU; siGnT-IVa-3:CCUUUCGACUG UCGGUUAG; 隨機(jī)序列(Scrambled sequence siRNA,NC):CAGUGUCAUA CGUACGACG。

1.4 細(xì)胞膜蛋白分離

將GnT-IVa基因干擾和對(duì)照組INS-1細(xì)胞消化、接種到6孔板,孵育過夜,用PBS漂洗1次,將培養(yǎng)基更換為葡萄糖濃度分別為5、11和25 mmol/L的完全培養(yǎng)基,加入終濃度為10 μmol/L京尼平苷繼續(xù)培養(yǎng)1 h。收集細(xì)胞,參照碧云天細(xì)胞膜和細(xì)胞漿蛋白分離試劑盒說明書要求分離細(xì)胞膜蛋白。大致實(shí)驗(yàn)步驟如下:

用蛋白提取劑A在冰浴中孵育10～15 min,勻漿30～50次后,將細(xì)胞裂解液在4 ℃、700×g下離心10 min,去除細(xì)胞核和未碎裂的細(xì)胞,于冷凍離心機(jī)4 ℃、14 000×g離心30 min,上清液即為細(xì)胞漿蛋白;向沉淀中加入200 μL膜蛋白提取劑B,以最大渦流速度重新懸浮10 s,冰浴15 min。裂解產(chǎn)物在4 ℃、14 000×g,離心5 min,收集上清液即為細(xì)胞膜蛋白。

1.5 蛋白免疫印跡分析

將各種分離的蛋白經(jīng)BCA法定量后,取20～30 μg蛋白上樣,經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下用封閉液 (5%脫脂奶粉)封閉2 h。用1∶2 000稀釋的GnT-IVa或GLUT2抗體在4 ℃孵育過夜,用TBST (20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,0.1% 吐溫20,pH值7.4)漂洗3次,每次10 min,洗去未結(jié)合的一抗;然后,用1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h,用TBST洗去未結(jié)合的二抗;最后,用ECL Western blotting試劑顯影、成像,用Image J軟件進(jìn)行條帶的密度分析。

1.6 葡萄糖攝取、ATP和胰島素含量測(cè)定

將GnT-IVa基因干擾和對(duì)照組INS-1細(xì)胞接種到6孔板,培養(yǎng)過夜。用KRBB緩沖溶液(129 mmol/L NaCl,4.8 mmol/L KCl,1.2 mmol/LMgSO4,1.2 mmol/L KH2PO4,2.5 mmol/L CaCl2,5 mmol/L NaHCO3,0.1% BSA,10 mmol/L HEPES,pH值7.4)漂洗1次,換成新鮮的KRBB饑餓2 h,隨后加入京尼平苷 (終濃度為10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)1 h。分別收集培養(yǎng)基上清液、全細(xì)胞裂解物,用商業(yè)化的葡萄糖、ATP和胰島素檢測(cè)試劑盒按照說明書的步驟測(cè)定上清液中葡萄糖和胰島素含量,以及全細(xì)胞裂解液中ATP的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。組間比較以p<0.05表示有顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GnT-IVa siRNA干擾效率分析

為明確GnT-IVa基因在京尼平苷調(diào)節(jié)GLUT2糖基化和在細(xì)胞膜上分布的影響,擬用siRNA干擾的方法敲低INS-1細(xì)胞中GnT-IVa基因表達(dá)水平。因此,首先對(duì)siRNA的轉(zhuǎn)染效率和干擾效率進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L時(shí),siRNA的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%左右,見圖1(a)和(b)。隨后,用50 nmol/L的siGnT-IVa轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,蛋白免疫印跡的結(jié)果證實(shí),siRNA3的干擾效率明顯高于siRNA1和siRNA2。50 nmol/L siRNA3 轉(zhuǎn)染48 h后,GnT-IVa的蛋白水平降低了約70% ,見圖1(c)。圖1(c)中,NC表示隨機(jī)序列,數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。

圖1 siRNA對(duì)INS-1細(xì)胞GnT-IVa基因的轉(zhuǎn)染及干擾效率

2.2 京尼平苷對(duì)GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中GLUT2蛋白糖基化水平的影響

在GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中考察京尼平苷對(duì)糖基化的GLUT2蛋白水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中,京尼平苷對(duì)GLUT2蛋白糖基化沒有明顯影響 (圖2),提示GnT-IVa在京尼平苷調(diào)節(jié)INS-1細(xì)胞中GLUT2糖基化過程中可能有重要作用。

NC:隨機(jī)序列; siRNA:siGnT-IVa-3; siRNA+Gen:siGnT-IVa-3+京尼平苷。數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (n=3)。

2.3 京尼平苷對(duì)GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中GLUT2在細(xì)胞膜上分布的影響

通過已有研究發(fā)現(xiàn),在中(11 mmol/L)、低(5 mmol/L)濃度葡萄糖條件下,京尼平苷可快速促進(jìn)糖基化的GLUT2從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn),提高胰腺β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和代謝能力,促進(jìn)胰島素分泌,但在高糖(25 mmol/L)條件下,京尼平苷發(fā)揮完全相反的作用。本文中,采用蛋白免疫印跡的方法在GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中考察京尼平苷在不同濃度葡萄糖條件下對(duì)GLUT2在細(xì)胞膜上分布的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中,京尼平苷對(duì)GLUT2在細(xì)胞膜上的分布沒有明顯影響。這一結(jié)果提示,京尼平苷調(diào)節(jié)GLUT2在細(xì)胞膜上的分布可能與GnT-IVa蛋白有一定的關(guān)系 (圖3)。

5:5 mmol/L葡萄糖;5+Gen:5 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L京尼平苷;11:11 mmol/L葡萄糖;11+Gen:11 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L京尼平苷;25:25 mmol/L葡萄糖;25+Gen:25 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L京尼平苷。(圖4同)。數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (n=3)。

2.4 京尼平苷對(duì)GnT-IVa干擾后的INS-1細(xì)胞葡萄糖吸收、代謝和胰島素分泌的影響

為進(jìn)一步明確GnT-IVa在京尼平苷調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞葡萄糖吸收、代謝和糖促胰島素分泌中的作用,在GnT-IVa基因干擾的INS-1細(xì)胞中考察京尼平苷對(duì)葡萄糖吸收、ATP生成和GSIS的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照組細(xì)胞中,在中 (11 mmol/L)、低 (5 mmol/L)葡萄糖濃度下,京尼平苷可明顯促進(jìn)葡萄糖吸收,增強(qiáng)ATP生成,提高GSIS;在高糖 (25 mmol/L)條件下,京尼平苷發(fā)揮完全相反的作用,不僅抑制葡萄糖吸收,減少ATP生成,而且抑制GSIS。但在GnT-IVa干擾后,京尼平苷的這些作用被明顯抑制,在高糖和中低濃度葡萄糖條件下,京尼平苷對(duì)INS-1細(xì)胞的葡萄糖吸收、代謝和GSIS都沒有明顯的影響 (圖4)。

A:葡萄糖攝取;B:ATP生成;C:GSIS。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (n=6)。* p<0.05 vs.單獨(dú)使用5 mmol/L葡萄糖;# p<0.05 vs.單獨(dú)使用11 mmol/L葡萄糖;& p<0.05和&& p<0.01 vs.單獨(dú)使用25 mmol/L葡萄糖。

3 結(jié)束語

GnT-IVa是糖基轉(zhuǎn)移酶家族 (GnTs)的一員,主要功能是在N-糖鏈的五碳糖核心上催化添加β-1,4糖鏈,廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)催化細(xì)胞內(nèi)如蛋白質(zhì)、脂類和核酸等其他分子糖基化,使其具有正常生物學(xué)功能[6,16]。多年來,GnT-IVa在癌細(xì)胞增殖機(jī)制中得到廣泛研究,但其在2型糖尿病防治研究方面的報(bào)道還很少見。近來,研究逐漸發(fā)現(xiàn),GnT-IVa在胰腺β細(xì)胞中高度表達(dá),其很可能參與了2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。GnT-IVa缺陷小鼠表現(xiàn)出高血糖癥,胰島素水平和糖耐量異常等現(xiàn)象。經(jīng)進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn),GnT-IVa缺陷與GLUT2蛋白功能障礙密切相關(guān)[17]。在GnT-IVa無活性的胰腺β細(xì)胞中,GLUT2通過內(nèi)吞作用被內(nèi)化,導(dǎo)致其功能受損。

通過siRNA干擾的方法考察了GnT-IVa與京尼平苷調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞GLUT2糖基化、葡萄糖吸收、代謝和胰島素分泌的相關(guān)性。研究結(jié)果表明,在GnT-IVa干擾的INS-1細(xì)胞中,京尼平苷對(duì)GLUT2的糖基化水平影響被明顯抑制;在不同糖濃度條件下,京尼平苷對(duì)胰腺β細(xì)胞葡萄糖吸收、ATP生成和胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用也被明顯抑制。提示GnT-IVa在京尼平苷調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞GLUT2糖基化、葡萄糖吸收、代謝和GSIS過程中具有重要作用。

梔子是一種藥食兩用植物,史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清熱利濕、瀉火除煩、涼血解毒、消腫止痛等功效,還有抗哮喘、急性胰腺炎、胃炎、降血糖、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[18-19]。近年來,梔子及其主要活性成分京尼平苷對(duì)慢性代謝疾病的影響受到廣泛關(guān)注。京尼平苷能增加胰腺β細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450)的含量,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)炎癥的抵抗能力,維持胰腺組織的正常供血,有效改善胰腺炎的預(yù)后修復(fù)[20]。通過激活PPARγ受體增強(qiáng)下游基因?qū)σ葝u素的響應(yīng)程度,京尼平苷可以減輕胰島β細(xì)胞補(bǔ)償性分泌胰島素的負(fù)荷,減緩胰島β細(xì)胞的凋亡,從而阻止2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[21-22]。同時(shí),京尼平苷具有降低腎上腺素所致高血糖、地塞米松致胰島素抵抗高血糖和四氧嘧啶致糖尿病高血糖的作用[23]。

本課題組通過高通量篩選發(fā)現(xiàn),京尼平苷是胰高血糖素樣肽-1 (glucagons-like peptidel-1,GLP-1)受體的選擇性激動(dòng)劑,可通過激活GLP-1受體發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)功能[24-25]。通過激活GLP-1受體,京尼平苷能夠顯著調(diào)節(jié)INS-1和原代大鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌[13,15,26,27]。此外,京尼平苷還可以通過促進(jìn)胰島淀粉樣多肽的降解,拮抗其誘導(dǎo)的β細(xì)胞的損傷和凋亡[11,28],抑制高糖、高脂條件下β細(xì)胞的氧化應(yīng)激、非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)和炎癥因子等誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡[29-30]。上述研究結(jié)果表明,京尼平苷可能在2型糖尿病的防治中具有廣闊應(yīng)用前景。