MDCK-MDR1細胞藥物體外吸收模型的建立及驗證

韓帥 張潔 金婷婷 閆茹冰 褚海辰, 梁永新,3

(1 青島大學醫學部,山東 青島 266071;2 青島大學附屬醫院麻醉科;3 青島大學附屬婦女兒童醫院麻醉科)

口服給藥是臨床上最廣泛的給藥方式之一,藥物在消化道吸收的速度和程度是影響藥物生物利用度的主要因素［1-2］。MDR1轉染犬腎細胞(MDR1-MDCK)是將人的多耐藥基因轉染MDCK細胞形成的穩定細胞系,能夠分化成連接緊密和表達高轉運蛋白的單層極性細胞［3-4］。MDCK-MDR1細胞體外吸收模型被廣泛用于口服藥物腸道上皮吸收轉運機制的研究中［5-7］。但由于MDCK-MDR1細胞來源以及各實驗室培養條件不同,各實驗室對MDCK-MDR1細胞模型的建立方法和檢驗標準也存在一定的差異。本研究通過對MDCK-MDR1細胞形態特征、生長活力、跨膜電阻(TEER)值和熒光黃表觀滲透系數(Papp)等參數進行檢測,擬構建可重復性強、穩定性好的MDCK-MDR1細胞體外吸收模型,為藥物體外穿膜機制的研究提供可靠的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MDCK-MDR1細胞由上海青旗生物技術發展有限公司提供,CCK-8試劑盒由上海翊圣生物科技有限公司生產,熒光黃由北京謹明生物科技有限公司生產,EVOM2跨膜細胞電阻儀購自美國World Precision Instruments公司,NIB620-FL倒置顯微鏡購自安徽耐可視科技股份有限公司。

1.2 MDCK-MDR1細胞培養及形態觀察

將MDCK-MDR1細胞置于DMEM高糖培養基(含有1×105U/L青霉素/鏈霉素/兩性霉素B、2 mmol/L谷氨酰胺和體積分數0.10的FBS)中,于37 ℃、含有體積分數0.05 CO2的培養箱中培養。待MDCK-MDR1細胞(20～35代)處于對數生長期時,分別按濃度1.0×108/L(L組)、2.5×108/L(M組)、5.0×108/L(H組)接種于24孔Transwell培養板(后文簡稱“培養板”)上,從培養板的濾膜頂端(AP)以及基底側(BL)分別加入400、600 μL的DMEM高糖培養基,各組細胞均培養7 d,每天更換DMEM高糖培養基,分別于第1、3、5天于NIB620-FL倒置顯微鏡下觀察各組MDCK-MDR1細胞的形態變化情況。

1.3 MDCK-MDR1細胞增殖數量的測定

將培養達到對數生長期的L、M、H組MDCK-MDR1細胞接種于培養板上,按1.2中的方法進行培養,共培養7 d。每天分別從L、M、H組中各取出3孔細胞,以Hank平衡鹽溶液(HBSS)洗滌2次后,每孔再分別加入100 μL的DMEM高糖培養基和10 μL的CCK-8試劑,將培養板再次置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中繼續培養2 h后,將各孔中的細胞和培養液轉移至96孔板中,采用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值,繪制細胞生長曲線。

1.4 MDCK-MDR1細胞TEER值的測定

將培養達到對數生長期的L、M、H組MDCK-MDR1細胞接種于培養板上,同時將不加MDCK-MDR1細胞的DMEM高糖培養基作為對照,按1.2中的方法進行培養,共培養7 d。每天分別從對照和L、M、H組中各取出3孔細胞,棄去孔中的DMEM高糖培養基,再將400、600 μL的HBSS分別加入培養板的AP側和BL側。TEER值測定開始前,將EVOM2跨膜細胞電阻儀電極置于預熱至37 ℃ HBSS中平衡15～20 min。每孔重復測量3次,結果取均值。TEER值計算公式：TEER=(TEER測定-TEERR對照)×0.33 cm2,其中TEER測定為L、M、H組培養板孔中的電阻值,TEER對照為對照培養板孔中的電阻值。

1.5 MDCK-MDR1細胞單層膜結構通透性的驗證

1.5.1熒光黃標準曲線繪制 用HBSS將熒光黃稀釋成0.005、0.010、0.025、0.050和0.100 mg/L的濃度,隨后采用酶標儀測量不同濃度熒光黃的熒光強度(激發波長427 nm,發射波長536 nm),以熒光強度為縱坐標,熒光黃濃度為橫坐標,繪制熒光黃標準曲線。

1.5.2熒光黃轉運實驗 根據1.2～1.4中的實驗結果,確定MDCK-MDR1細胞形成單層膜結構的最佳接種濃度和培養時間,按照1.2的方法將最佳接種濃度的MDCK-MDR1細胞接種于培養板上,培養至最佳培養時間時,取出3孔細胞吸棄DMEM高糖培養基后,從培養板AP側加入20 mg/L熒光黃400 μL,BL側加入600 μL的HBSS,置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中再培養1 h。分別于培養0.5、1.0 h時從每孔的BL側取樣100 μL,再補充相同體積的HBSS,以酶標儀測量各孔中BL側熒光黃的熒光強度(激發波長427 nm以及發射波長536 nm)。參考熒光黃標準曲線,計算各孔BL側熒光黃Papp值,以Papp值<5.0×10-7cm/s作為細胞單層膜結構的通透性達到通透性試驗要求的標準［8］。

2 結 果

2.1 MDCK-MDR1細胞生長形態觀察

倒置顯微鏡下觀察顯示,MDCK-MDR1細胞在培養板中貼壁生長,呈扁平狀,自發性上皮樣分化。L、M、H組的MDCK-MDR1細胞分別在第5、3、1天時形成單層膜結構。形成單層膜結構后,MDCK-MDR1細胞間連接緊密,細胞數量達到峰值。H組在第5天時出現細胞成團現象(圖1)。

圖1 各組MDCK-MDR1細胞培養不同時間時的細胞形態觀察(20倍)

2.2 各組MDCK-MDR1細胞增殖數量比較

各組MDCK-MDR1細胞的增殖數量均呈現先上升后下降的趨勢,L、M和H組的細胞數量分別在第5、4、3天時達到峰值。重復測量設計方差分析結果顯示,時間、組別、時間和組別交互作用對MDCK-MDR1細胞的增殖數量均有顯著影響(F時間=41.133,F組別=29.385,F時間*組別=13.211,P<0.05)。在細胞生長早期(1～3 d),H組的MDCK-MDR1細胞增殖數量明顯高于L組以及M組(F=26.241～34.645,P<0.05)。在細胞生長的中晚期(5～7 d),H組MDCK-MDR1細胞增殖數量明顯低于L組和M組(F=32.256～41.778,P<0.05)。見表1。

表1 各組MDCK-MDR1細胞第1～7天A值比較

2.3 各組MDCK-MDR1細胞TEER值比較

各組MDCK-MDR1細胞的TEER值在第1～5天時均隨培養時間的延長而增加,并于第6天時基本趨于穩定,達到300 Ω·cm2。重復測量設計的方差分析結果顯示,時間、組別、時間和組別交互作用對MDCK-MDR1細胞的TEER值均具有顯著影響(F時間=26.784,F組別=31.247,F時間*組別=25.773,P<0.05)。與M組和H組相比,L組的TEER值在第5天顯著增高(F=13.621,P<0.05),且最快達到300 Ω·cm2左右。在第6～7天時,各組的TEER值進行比較,其差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組MDCK-MDR1細胞第1～7天TEER值比較

2.4 MDCK-MDR1細胞單層通透性的驗證

本研究繪制的不同濃度熒光黃標準曲線為Y=674693X+720.86,R2為0.999 7。根據各組MDCK-MDR1細胞不同培養時間細胞的生長形態、生長曲線和TEER值結果可以發現,L組細胞在接種第5天時吸光度值達到峰值,且成團死亡的細胞數較少,TEER值在第5～7天趨于穩定,故認為MDCK-MDR1細胞形成單層膜結構的最佳接種濃度為1.0×108/L,最佳的培養時間為第5天。在此條件下進行的熒光黃轉運實驗,測得的0.5 h和1.0 h時BL側熒光強度分別為126±17和382±35,Papp=4.27×10-7cm/s,低于5.0×10-7cm/s,模型驗證成功,構建的MDCK-MDR1細胞單層膜結構的通透性符合通透性實驗的要求,能夠用于模擬口服藥物吸收和轉運機制的研究。

3 討 論

口服是臨床中首選的給藥途徑,與其他給藥途徑相比,具有給藥方式簡便以及患者依從性好等優點［9-10］。藥物在腸道內的吸收速度及吸收程度是影響藥物生物利用度的重要因素。藥物在胃腸道的吸收途徑主要有以下幾種：①跨細胞途徑：藥物借助其脂溶性或細胞膜上的載體穿過細胞被吸收,包括被動轉運和主動轉運兩種機制;②細胞旁路途徑：是水溶性小分子吸收的重要途徑,屬于被動轉運;③內吞：藥物吸附在細胞膜上,通過膜的凹陷進入細胞形成小泡被吸收;④經派伊爾結(PPs)上的M細胞吸收到淋巴循環：微粒和一些抗原性物質被M細胞攝取以后轉運至PPs,被PPs內的巨噬細胞吞噬,經淋巴循環進入血液完成吸收過程。此外,胃腸黏膜的通透性、藥物的溶解度、代謝的穩定性、pH值、胃腸道表面積、吸收以及外排轉運體的活性等因素,也均會影響到藥物的口服生物利用度。人克隆結腸腺癌(Caco-2)細胞和MDCK細胞模型是目前藥物吸收滲透性研究應用最多的模型［11-12］,但Caco-2細胞缺少黏液層,培養周期較長(21 d),MDCK細胞表達轉運蛋白的水平低且來源于動物［13］。與Caco-2細胞和MDCK細胞相比較,MDCK-MDR1細胞能夠高效表達P-糖蛋白［14-15］,實驗成本低,培養周期短(3～5 d),結果重現性好［16-17］。MDCK-MDR1細胞在體外培養時能進行形態和功能的分化,被認為是研究口服藥物前期篩選、營養素與毒素吸收最好細胞模型之一。雖然MDCK-MDR1細胞模型具備許多優勢,但目前對于構建該模型時MDCK-MDR1細胞接種的濃度和培養時間并未達成一致。

本研究通過在倒置顯微鏡下面觀察MDCK-MDR1細胞生長形態、繪制細胞的生長曲線、測定TEER值評價細胞單層膜結構的完整性來選擇最佳的MDCK-MDR1細胞接種濃度和培養時間。后續通過熒光黃轉運實驗驗證MDCK-MDR1細胞單層膜的通透性。本研究選取了MDCK-MDR1細胞的3種接種濃度,各組細胞接種早期生長迅速,吸光度值和TEER值顯著升高,隨后呈現趨于穩定的趨勢,其中H組的吸光度值最早達到峰值,但是由于培養基中維持細胞生長的營養物質減少,代謝產物增加,細胞因為能量耗竭和代謝紊亂出現密度抑制,最終細胞停止分裂,凋亡增加,吸光度值降低。各組MDCK-MDR1細胞TEER值均隨培養時間延長而增加,于第6天時基本趨于穩定,達到300 Ω·cm2左右,其中L組細胞的TEER值在1～3 d增加緩慢,4～5 d增長迅速,第5天達到300 Ω·cm2后基本穩定,并保持穩定至第7天,M組和H組細胞的TEER值在1～4 d增長稍平緩,5～6 d快速增長,在第6天達到300 Ω·cm2。一般情況下,跨膜電阻值約為200～1 000 Ω·cm2時,細胞單層膜結構完整性好［18-19］,致密度越高,TEER值也就越大［20-22］。結合上述情況,本研究確定的MDCK-MDR1細胞形成單層膜結構的最佳接種濃度為1.0×108/L,最佳培養時間為5 d。

通過熒光黃轉運實驗對1.0×108/L的MDCK-MDR1細胞接種濃度、培養5 d的單層膜結構進行驗證。結果顯示,從培養板AP側至BL側的熒光黃Papp為4.27×10-7cm/s,低于通透性實驗規定的5.0×10-7cm/s,證明該細胞單層膜結構完整,連接緊密性良好,且符合通透性實驗的要求。

綜上所述,MDCK-MDR1細胞體外吸收模型與細胞接種密度、構建時間密切相關。在本實驗室條件下,MDCK-MDR1細胞接種濃度為1.0×108/L,連續培養5 d,顯微鏡下觀察MDCK-MDR1細胞形態良好,生長迅速,TEER值趨于穩定,具有較低的熒光黃滲透率,證明MDCK-MDR1細胞形成單層膜結構且完整性好,可以作為模擬藥物的體外腸道吸收轉運模型。

作者聲明：韓帥、閆茹冰、梁永新參與了研究設計;韓帥、金婷婷、張潔、褚海辰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。