隱丹參酮對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

張海霞 李康康 程明陽 陳雪紅

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)藥理學(xué)系,山東 青島 266071;2 淄博市第一醫(yī)院藥品調(diào)劑科)

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤［1］,早期階段可以通過手術(shù)治療,但預(yù)后不好,易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。約有80%的患者確診時(shí)已是中晚期［2］,錯(cuò)過有效的手術(shù)時(shí)機(jī),通常只能使用藥物進(jìn)行治療［3］。雖然臨床可用的化療藥物可顯著改善肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后,但毒副作用較大,還易產(chǎn)生藥物耐受［4］,因此臨床迫切需要尋找更為安全有效的藥物對(duì)肝癌患者進(jìn)行治療。

近年來,多種植物來源的天然化合物被開發(fā)用于腫瘤治療,且表現(xiàn)出高效低毒的特性［5］。隱丹參酮(CPT)是從中藥丹參中提取出的一種橙色針狀結(jié)晶的天然活性化合物,易溶于氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑,微溶于水。具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化等作用,被廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病、癌癥等多種疾病的治療［6-8］。研究發(fā)現(xiàn),CPT可有效抑制肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)展［9-11］,其還可以有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［12］,但目前關(guān)于CPT是否可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的自噬尚不清楚。本研究通過檢測(cè)不同濃度的CPT處理HepG2細(xì)胞以后,對(duì)細(xì)胞活性、遷移能力以及細(xì)胞凋亡率的影響,以及加入自噬抑制劑Spautin-1后,HepG2細(xì)胞凋亡情況的變化,探討CPT對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制,旨在為CPT應(yīng)用于肝癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

MTT試劑盒、JC-1試劑盒以及FITC Annexin V-PI流式凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);PMSF、彩色預(yù)染Marker、ECL化學(xué)發(fā)光液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);CPT、Spautin-1(上海麥克林生化科技股份有限公司);LC3B-Ⅱ和β肌動(dòng)蛋白(β-ACTIN)抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CPT對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

HepG2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司)和體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司)的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CPT和Spautin-1均先使用二甲基亞砜(DMSO)溶解配成母液,然后使用無血清培養(yǎng)基配制成實(shí)驗(yàn)所需的各種濃度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板之中,培養(yǎng)24 h。吸出原培養(yǎng)液以后,分別加入濃度為0、1、5、10、20、40、100 μmol/L的CPT培養(yǎng)液100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸出原培養(yǎng)液,加入100 μL的MTT溶液,再孵育4 h。吸出MTT溶液,加入100 μL DMSO,搖床振蕩5 min,以酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞活性和半數(shù)致死濃度(IC50)值。以IC50值為依據(jù),選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的CPT濃度。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CPT對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞密度大于90%時(shí),使用200 μL槍頭對(duì)板底部細(xì)胞進(jìn)行劃痕,PBS洗2次,于培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、1、5、10 μmol/L的CPT培養(yǎng)液100 μL(A～D組),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。倒置光學(xué)顯微鏡下(日本尼康株式會(huì)社)觀察、拍照,記錄劃痕愈合情況并計(jì)算遷移率。

1.4 JC-1染色檢測(cè)CPT對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,取培養(yǎng)48 h的A～D組細(xì)胞,吸去上層培養(yǎng)液,然后加入JC-1工作液,室溫下避光孵育30 min,PBS清洗3次。熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡儀器有限公司)下觀察、拍照。計(jì)算綠色熒光與紅色熒光比值,該比值越大,表示線粒體膜電位越低。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CPT對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

取培養(yǎng)24 h的A、B、C、D組細(xì)胞,置于離心管中,以800 r/min離心5 min,PBS緩沖液重懸,再以800 r/min離心5 min,棄上清液,每管加300 μL上樣緩沖液重懸后,分別加入5 μL FITC Annexin V和10 μL PI染色液。使用流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司)分析HepG2細(xì)胞的凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)用自噬抑制劑Spautin-1和CPT對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中,設(shè)置為E～H組,分別加入含0 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1、1 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1、5 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1以及10 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1的無血清培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞活性。

1.7 Western blot方法檢測(cè)Spautin-1以及CPT對(duì)HepG2細(xì)胞LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

取培養(yǎng)48 h的A、D、H組細(xì)胞,裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液。12 000 r/min離心30 min,分離上清液,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肂CA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后。然后使用PAGE凝膠快速制備試劑盒制備SDS-PAGE凝膠,每孔上樣10～20 μL樣品后,80 V電泳20 min,120 V電泳60～80 min。隨后300 mA轉(zhuǎn)膜90 min,BSA封閉液封閉1 h,一抗4 ℃下孵育12 h,二抗室溫孵育2 h后,ECL顯影,顯影儀(法國(guó)VILBER LOURMAT公司)下拍照,Image J對(duì)條帶進(jìn)行量化。

1.8 JC-1染色檢測(cè)Spautin-1和CPT對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

取培養(yǎng)48 h的A、D、E、H組細(xì)胞,按1.4方法對(duì)各組細(xì)胞染色,計(jì)算綠色熒光與紅色熒光比值。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Spautin-1和CPT對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

取培養(yǎng)24 h的A、D、E、H組細(xì)胞,按1.5方法分析各組細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 CPT對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

0、1、5、10、20、40、100 μmol/L濃度的CPT處理48 h時(shí),HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性分別為(100.3±1.2)%、(83.7±4.0)%、(46.1±4.4)%、(22.1±2.3)%、(20.5±3.8)%、(19.1±1.2)%、(16.1±2.1)%。各濃度比較差異具有顯著性(F=377.50,P<0.05);隨著CPT濃度的升高,HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性呈顯著性下降(t=5.40～25.26,P<0.05)。通過計(jì)算CPT作用HepG2細(xì)胞48 h時(shí)的IC50值為3.9 μmol/L。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用0、1、5及10 μmol/L的CPT用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CPT對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

CPT作用于HepG2細(xì)胞48 h以后,A～D組細(xì)胞的遷移率分別為(54.51±3.15)%、(37.14±3.11)%、(22.45±2.98)%、(0.00±0.19)%,各組間比較,HepG2細(xì)胞的遷移率差異具有顯著性(F=508.90,P<0.05),且隨著CPT濃度的升高,抑制HepG2細(xì)胞遷移能力逐漸增強(qiáng)(t=5.96～29.63,P<0.05)。

2.3 CPT對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

JC-1染色結(jié)果顯示,A～D組HepG2細(xì)胞處理48 h時(shí),綠色熒光與紅色熒光比值分別為0.00±0.03、0.45±0.15、1.50±0.19、7.18±0.59,各組間比較差異有顯著性(F=333.20,P<0.05),隨著CPT濃度的升高,HepG2細(xì)胞中綠色熒光逐漸增強(qiáng),綠色熒光與紅色熒光的比值也逐漸升高(t=4.24～23.36,P<0.05)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,A～D組HepG2細(xì)胞處理24 h時(shí),HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為(7.22±1.91)%、(16.85±3.40)%、(24.52±1.86)%、(30.22±2.96)%。各組間比較差異有顯著意義(F=160.90,P<0.05),隨著CPT濃度的升高,HepG2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率逐漸增高(t=7.30～18.15,P<0.05)。

2.4 聯(lián)用自噬抑制劑Spautin-1和CPT對(duì)HepG2細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,E～H組細(xì)胞處理48 h以后,細(xì)胞活性分別為(92.60±3.44)%、(86.84±2.28)%、(64.89±3.86)%、(45.04±2.92)%,各組間比較,細(xì)胞活性均具有顯著性差異(F=231.15,P<0.05),E組與A組、F組與B組、G組與C組、H組與D組相比,細(xì)胞活性均增加(t=3.96～18.80,P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,A、D、H組LC3B-Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為100.21±15.36、319.56±33.89、192.36±22.58。3組細(xì)胞的LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)比較差異均有顯著性(F=602.36,P<0.05),其中A組、H組與D組比較,HepG2細(xì)胞中LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)比較均具有顯著差異(t=9.17、3.52,P<0.05)。

JC-1染色結(jié)果顯示,A、D、E、H組HepG2細(xì)胞的綠色熒光與紅色熒光比值分別為0.13±0.05、3.02±0.15、0.31±0.16、0.68±0.24,各組間比較差異有顯著性(F=103.25,P<0.05),其中E組與A組比較,差異無顯著性(P>0.05);E組、H組與D組比較有顯著差異(t=3.58、14.76,P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,A、D、E、H組HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為8.51±2.44、29.99±2.39、10.42±1.15、20.35±2.72,各組間比較差異有顯著性(F=221.69,P<0.05),其中E組與A組比較,該比值無顯著差異(P>0.05),E組、H組與D組進(jìn)行比較該比值均有顯著差異(t=12.38、4.99,P<0.05)。

3 討 論

丹參通常使用其干燥根入藥,被用于治療多種疾病,例如心腦血管病、肝病、血液系統(tǒng)疾病、出血、月經(jīng)紊亂、流產(chǎn)和失眠等［13］。CPT作為丹參的主要二萜衍生物,在不同的疾病中均表現(xiàn)出了優(yōu)異的藥理活性,尤其在腫瘤的預(yù)防和治療方面具有巨大潛力［14］。研究表明CPT對(duì)肺癌、白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、神經(jīng)瘤、膀胱癌等均具有抑制作用［15-16］,其作用機(jī)制主要包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲、血管生成、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)免疫、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬等［16-17］。如CHEN等［14］研究發(fā)現(xiàn),CPT可調(diào)節(jié)AMPK/TSC2/mTOR信號(hào)通路,并且通過上調(diào)AMPK刺激TSC2,進(jìn)而抑制mTOR信號(hào)通路,達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的作用。

本研究發(fā)現(xiàn),CPT能顯著抑制HepG2細(xì)胞活性,48 h時(shí)的IC50值為3.9 μmol/L。細(xì)胞遷移是肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素,CPT可以通過抑制MMP-2和MMP-9以及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,從兩個(gè)方面干擾結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移［18］。還有研究表明CPT通過下調(diào)PGE2誘導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白表達(dá)和通過上調(diào)E-鈣黏蛋白和GSK3-β表達(dá)抑制細(xì)胞遷移［19］。因此,針對(duì)CPT的抗遷移活性,本研究將梯度濃度的CPT處理HepG2細(xì)胞48 h,結(jié)果顯示CPT以濃度依賴的方式抑制HepG2細(xì)胞遷移。研究發(fā)現(xiàn),CPT可以通過抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)磷酸化,從而調(diào)節(jié)線粒體功能并抑制腫瘤的進(jìn)展［20］。由此可以推測(cè)CPT可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的線粒體功能。本研究JC-1染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞經(jīng)過CPT處理后綠色熒光與紅色熒光比值降低,線粒體膜電位下降,功能失調(diào),這可能是由于CPT抑制了STAT3活性,從而使線粒體功能失調(diào)。為進(jìn)一步研究CPT的凋亡誘導(dǎo)作用,本研究又通過流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度CPT處理24 h后凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析,結(jié)果顯示CPT可以有效誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

有研究顯示CPT可通過激活腫瘤細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。自噬是細(xì)胞物質(zhì)被運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解的過程,真核細(xì)胞利用自噬來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)［22］。自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激環(huán)境的重要手段之一,其在癌癥發(fā)展的不同階段中發(fā)揮著兩種完全相反的作用,即抑瘤和促瘤作用［23］。在癌癥發(fā)展早期,自噬可以有效控制細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展［23］;但當(dāng)癌癥進(jìn)展到晚期,由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過快,腫瘤內(nèi)部嚴(yán)重缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等,在這種環(huán)境下自噬則成為了保護(hù)癌細(xì)胞存活的有效手段［23］。XU等［24］研究發(fā)現(xiàn),CPT通過誘導(dǎo)ROS積累從而激活MAPK/NF/kB信號(hào)通路,誘導(dǎo)多藥耐藥人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的自噬和細(xì)胞死亡。基于此本研究通過CPT聯(lián)用自噬抑制劑Spautin-1探討了CPT是否是通過自噬誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的,MTT結(jié)果顯示,Spautin-1的加入逆轉(zhuǎn)了CPT對(duì)于HepG2細(xì)胞活性的抑制;同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Spautin-1可以顯著降低CPT誘導(dǎo)的自噬關(guān)鍵蛋白LC3B-Ⅱ的表達(dá)。由此可以推測(cè)CPT是通過自噬抑制了HepG2細(xì)胞的增殖。LUO等［25］研究發(fā)現(xiàn)CPT是通過PI3K/AKT/mTOR途徑誘導(dǎo)Huh7和MHCC97-H細(xì)胞的凋亡和自噬,進(jìn)一步抑制其增殖。本課題組先前的研究也發(fā)現(xiàn),CPT可以通過激活結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。本研究中JC-1染色和流式凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于單用CPT,聯(lián)用自噬抑制劑Spautin-1后綠色熒光和紅色熒光比值降低,凋亡細(xì)胞減少。提示CPT對(duì)HepG2細(xì)胞活性的抑制以及對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用,可能是通過誘導(dǎo)自噬實(shí)現(xiàn)的,這為CPT的研究拓展了思路。

綜上,從臨床常用的中藥丹參中提取的天然化合物CPT,可以通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡抑制其增殖和遷移,其作用機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)自噬進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。本研究為CPT應(yīng)用于肝癌治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)支持。

作者聲明：張海霞、李康康、程明陽、陳雪紅參與了研究設(shè)計(jì);張海霞、李康康、陳雪紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。