盆腔腫瘤患者同步放化療對外周血淋巴細胞、細胞因子和腸道菌群的影響

呂卓純 陳曉慧 秦琛 鞠芳

(1 青島大學醫學部,山東 青島 266071;2 青島大學附屬青島市中心醫院,青島市腫瘤醫院腫瘤科)

宮頸癌和直腸癌是常見的盆腔腫瘤,同步放化療是很多局部晚期盆腔腫瘤患者的首選治療方案,也是盆腔腫瘤多學科綜合治療的重要部分［1-2］。近年來,關于宮頸癌、直腸癌患者放化療對機體影響的研究,多以全身免疫炎癥指數及外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值作為檢測指標［3］,沒有進一步分析這些指標具體的影響機制,而且對腸道微生態與療效相關性的研究報道也比較少。本研究選擇宮頸鱗癌及直腸腺癌患者作為研究對象,分析患者同步放化療前后外周血中淋巴細胞、細胞因子和糞便中腸道菌群的變化,并進一步分析有顯著變化的指標與療效的關系,為探討盆腔腫瘤同步放化療對機體免疫功能、炎癥狀態和腸道微生態的影響及其機制提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2021年7月—2022年12月青島市中心醫院收治的病理確診為宮頸鱗癌或直腸腺癌的患者60例,其中宮頸鱗癌30例,直腸腺癌30例。納入標準：①年齡18～75歲者;②體力活動狀態(PS)評分0～2分者;③宮頸鱗癌患者均符合美國國家癌癥網(NCCN)診療指南根治性同步放化療指征,直腸腺癌患者均符合中國臨床腫瘤學會(CSCO)診療指南新輔助同步放化療指征［4］。排除標準：①治療前2個月內接受過系統性抗菌藥物或者益生菌治療者,2周內接受過任何質子泵抑制劑治療者;②治療前6個月內接受過腹盆腔放療及系統性化療者;③合并炎癥性腸病或者腸易激惹綜合征等腸炎疾病者;④合并有自身免疫性疾病者;⑤合并嚴重的心血管、肝臟、腎臟等疾病,即存在放化療禁忌證者;⑥同步放化療過程中出現不良反應需行粒細胞集落刺激因子或激素治療者。

1.2 同步放化療方案

宮頸鱗癌患者采用容積弧形調強技術盆腔照射50.4 Gy/28 F,5次/周,腔內照射治療A點劑量為6 Gy/F,1次/周,共4～5次,同步順鉑25 mg/m2,靜脈滴注,1次/周。直腸腺癌患者采用容積弧形調強放療技術盆腔照射50 Gy/25 F,5次/周,同步卡培他濱825 mg/m2,每天2次,口服,5次/周。

1.3 樣本采集

分別于盆腔放療開始前3 d內和結束后3 d內,采集患者清晨空腹狀態外周靜脈血4 mL,用乙二胺四乙酸抗凝處理,6 h內進行外周血指標檢測;同期收集患者清晨糞便標本1管(1.0～2.0 g),2 h內置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 觀察指標的檢測

1.4.1外周血淋巴細胞亞群檢測 使用Cytomics FC500流式細胞儀(美國BECKMAN COULTER公司)和淋巴細胞亞群檢測試劑盒(美國BD Biosciences公司),以熒光激活細胞分選法檢測外周血中B細胞(CD3-CD19+)、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+、自然殺傷細胞(CD3-CD16+CD56+),并計算細胞百分比。

1.4.2外周血細胞因子檢測 使用BriCyte E6流式細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)和細胞因子檢測試劑盒(青島瑞斯凱爾生物科技有限公司),通過熒光激活細胞分選法檢測患者外周血中白細胞介素1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、γ干擾素(IFN-γ)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

1.4.3糞便腸道菌群檢測 使用E.Z.N.A.?Mag-Bind Stool DNA Kit(200)DNA提取盒(美國Omega Bio-Tek公司),根據試劑盒上的指示進行操作。提取DNA之后使用SMA4000超微量紫外可見核酸蛋白分析儀(北京美林恒通儀器有限公司)測量DNA的濃度,DNA吸光度(A)值滿足A260/A280≈1.7～1.9。設計具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌引物序列［5-7］,引物名稱及其序列見表1,由Invitrogen公司合成。使用各目標菌的質粒(北京擎科生物科技股份有限公司)作為標準品,將各目標菌的標準品分別進行6次10倍稀釋,獲得10-1～10-6共6個濃度梯度的標準品。以不同濃度的標準品作為模板進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測,以模板數的對數值為橫坐標,Ct值為縱坐標繪制標準曲線。使用TransStart?Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術股份有限公司)配制反應體系：2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,DNA模板2 μL,去離子水7.2 μL。RT-qPCR反應程序：94 ℃預熱30 s;94 ℃變性5 s,60 ℃延伸30 s,共循環45次,每次延伸階段采集熒光信號,反應結束后進行溶解曲線分析。記錄CT值及溶解曲線,將CT值代入標準曲線公式,得出每克糞便樣品中待測細菌基因拷貝數的對數值。

表1 引物名稱及其序列

1.5 療效評價

首次同步放化療前14 d內及同步放化療結束后(30±3)d內行盆腔MRI檢查,根據實體瘤療效評價標準1.1版本［8］進行客觀療效評價,包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)4種療效等級。將影像學評估達到CR和PR的患者納入療效較好組,達到SD和PD的患者納入療效較差組。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 患者同步放化療前后外周血淋巴細胞亞群變化

患者進行同步放化療以后外周血CD3+CD8+和CD3-CD19+細胞百分比較治療前均顯著性降低(t=2.995、2.779,P<0.05),CD3+、CD3+CD4+細胞百分比以及CD4+/CD8+比值較治療前均顯著升高(t=-4.321～-2.638,P<0.05)。見表2。

表2 患者同步放化療前后外周血淋巴細胞亞群變化

2.2 患者同步放化療前后外周血細胞因子變化

患者同步放化療后外周血中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平相較于治療前均顯著升高(t=-3.422～-2.678,P<0.05),IL-10水平較治療前顯著降低(t=2.571,P<0.05)。見表3。

表3 患者同步放化療前后外周血細胞因子變化

2.3 患者同步放化療前后糞便腸道菌群變化

患者同步放化療后糞便具核梭桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌數量較治療前顯著減少(t=3.128～3.954,P<0.05)。見表4。

表4 患者同步放化療前后糞便中腸道菌群的變化

2.4 患者同步放化療后外周血淋巴細胞亞群、細胞因子和糞便腸道菌群與療效的相關性

本研究結果顯示,療效較好組47例,療效較差組13例。將患者治療前后存在差異變化的外周血淋巴細胞亞群、細胞因子和糞便腸道菌群指標與療效進行相關性分析,結果顯示患者外周血CD3+細胞百分比、CD3+CD4+細胞百分比和糞便雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌數量與療效呈正相關(rs=0.440～0.540,P<0.05);外周血IL-6、TNF-α水平和糞便具核梭桿菌數量與療效呈負相關(rs=-0.685～-0.377,P<0.05)。

3 討 論

宮頸癌和直腸癌作為常見的盆腔腫瘤,其早期臨床癥狀常較為隱匿,很多患者確診時已發展為中晚期［9］。同步放化療是局部晚期宮頸癌和直腸癌患者的重要治療手段,同步放化療較單純放療、化療有效率更高。新輔助同步放化療可降低直腸癌患者術后復發率,根治性同步放化療可顯著延長不可切除的宮頸癌患者生存期。近年來研究發現,機體免疫功能、炎癥狀態和腸道微生態在腫瘤的發生、發展中有重要地位,且與腫瘤的療效密切相關［10-12］。而盆腔同步放化療對機體免疫功能、炎癥狀態和腸道菌群是否產生影響,以及是否進一步影響療效,還有待進一步研究。

淋巴細胞及細胞因子是機體免疫和炎癥反應的重要組成部分,參與腫瘤的發生發展［13］,并可能與療效相關。淋巴細胞具有免疫識別功能,根據其表型和生物學功能,分為CD3+CD8+細胞毒性T細胞(CTLs)、CD3+CD4+輔助性T細胞(Th)、B細胞和自然殺傷細胞［14］。其中CTLs通過直接或間接殺傷腫瘤細胞發揮細胞免疫功能;Th可分為Th1和Th2,Th1分泌的IL-2和IFN-γ可誘導T細胞增殖、激活自然殺傷細胞,主要參與機體細胞免疫,能促進炎癥反應的發生,同時有研究發現腫瘤患者的IL-2低水平與預后不良相關。Th2分泌的IL-4和IL-10可促進B細胞分泌抗體,主要參與機體體液免疫,能同時抑制Th1所介導的免疫反應和由活性氧代謝產物所介導的炎癥反應［15-16］;B細胞通過分泌抗體發揮調節體液免疫功能,自然殺傷細胞通過分泌促炎因子和趨化因子參與機體的抗腫瘤、抗病毒過程。而促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α可通過它們各自受體誘導的信號傳導參與機體炎癥反應,促進腫瘤的發生、進展以及轉移［17-18］。有研究發現CD4+/CD8+比值能反映機體免疫功能,該比值下降則提示機體的免疫功能降低。腫瘤患者外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+細胞百分比以及CD4+/CD8+比值均較健康人群低,提示腫瘤患者機體免疫功能受到了抑制［19］。

本研究結果顯示,盆腔同步放化療后患者外周血CD3+、CD3+CD4+細胞百分比和CD4+/CD8+比值顯著增高,外周血CD3+CD8+及CD3-CD19+細胞百分比顯著降低;同時外周血促炎因子IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平顯著增高,外周血抗炎因子IL-10水平顯著降低。提示盆腔同步放化療可能激活機體抗腫瘤免疫功能,減輕機體免疫抑制狀態,促進機體炎癥反應的發生。結合淋巴細胞亞群變化和細胞因子變化分析,同步放化療后Th百分比以及由Th1分泌的IL-2、IFN-γ水平升高,提示同步放化療可能激活機體細胞免疫;而B細胞百分比以及由Th2分泌的IL-4、IL-10水平均降低,提示同步放化療可能抑制B細胞介導的體液免疫。在同步放化療時可以通過監測淋巴細胞亞群及細胞因子變化,更好地了解盆腔腫瘤患者機體免疫功能及炎癥狀態的變化。

腸道菌群是微生物在人體等宿主的腸道內共同進化形成的一個復雜的生態系統［20］。由于腸道處于缺氧環境,具核梭桿菌、雙歧桿菌等厭氧菌及嗜酸乳桿菌等兼性厭氧菌在腸道中起主導作用。研究發現具核梭桿菌可以促進炎癥反應、刺激癌細胞生長,可能參與結直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤的發生［21-23］。同時有研究發現雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和鏈球菌等益生菌能降低盆腔放療、化療或同步放化療所致的腹瀉發生率,并且可能與療效相關［24］。本研究采用能針對特定細菌進行準確檢測的RT-qPCR技術,選擇具核梭桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌以及鏈球菌4種前期研究顯示可能與腫瘤發生發展、療效相關的腸道細菌作為檢測對象,發現盆腔同步放化療后患者糞便具核梭桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌數量顯著減少。提示盆腔同步放化療可能造成致病菌和益生菌減少,出現腸道菌群紊亂。

將治療前后有差異的觀察指標與療效進行相關性分析發現,盆腔腫瘤患者治療后外周血中CD3+、CD4+細胞百分比高水平和糞便雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌高表達與療效較好相關,外周血IL-6、TNF-α的高水平和糞便具核梭桿菌高表達與療效較差相關。提示機體免疫功能、炎癥狀態和腸道菌群與療效有一定的相關性。因此,可望通過檢測上述指標的變化預測患者療效,并有可能通過調節機體免疫炎癥狀態調控放化療療效,值得臨床進一步研究。

綜上所述,本研究發現盆腔腫瘤患者同步放化療可激活機體抗腫瘤免疫功能,減輕機體免疫抑制狀態,促進機體炎癥反應的發生。另外,盆腔同步放化療可導致腸道益生菌和致病菌減少,造成腸道菌群紊亂、改變腸道微生態。同時,盆腔同步放化療后外周血中CD3+CD4+細胞百分比和糞便雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌數量與療效呈正相關,而外周血IL-6、TNF-α水平和糞便具核梭桿菌數量與療效呈負相關。但本研究納入的病例數較少,今后將擴大樣本量進一步研究,并觀察上述指標與不良反應的發生之間的關系,探討其具體作用機制。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬青島市中心醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號KY202110-601)。所有試驗過程均遵照《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》(2016)的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：呂卓純、鞠芳、陳曉慧參與了研究設計;呂卓純、鞠芳、秦琛參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。