宏基因組二代測序技術(shù)對疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病原診斷價值

林 霞 頡滿珍 王根緒 張慶華 趙傲楠

1.甘肅省天水市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，甘肅天水 741000；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200025

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是病原微生物侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦實質(zhì)、被膜及血管等引起的急性或慢性炎性疾病，因高發(fā)病率和病死率已成為神經(jīng)內(nèi)科的重點關(guān)注疾病。傳統(tǒng)的腦脊液培養(yǎng)可以識別30%～40%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（包括腦膜炎和腦炎）的病原體[1]，不能滿足臨床需要，患者無法得到早期診斷及精準用藥。2017 年，宏基因二代測序被法國“成人感染性腦炎管理指南”推薦為1 級證據(jù)，以協(xié)助中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床決策[2]。文獻[3]報道顯示宏基因二代測序可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的診斷率，但其陽性率僅22%。本研究旨在探究宏基因二代測序在疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的病原診斷價值，闡明其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的臨床優(yōu)化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2020 年7 月至2021 年12 月就診于天水市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科40 例疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，其中，男23 例，女17 例，年齡15 ～74 歲，平均（50.33±16.28）歲。患者及家屬均知情并且同意配合本研究進行的隨訪調(diào)研工作。本研究通過天水市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

納入標準[4-6]：①急性、亞急性或慢性起病；②有上呼吸道感染的前驅(qū)癥狀或腹瀉等感染癥狀；③神經(jīng)功能缺損癥狀，腦膜刺激征、精神行為異常、認知功能下降、癲癇、意識障礙、言語障礙、肢體癱瘓等；④神經(jīng)影像學提示腦炎、腦膜炎；⑤入院前未接受治療。排除標準：其他系統(tǒng)感染性疾病。

1.2 方法

全部入組患者行血常規(guī)、病毒五項、呼吸道病原體聯(lián)檢。腦脊液常規(guī)與生化、腦脊液抗酸染色與墨汁染色、腦脊液結(jié)核DNA 與單純皰疹病毒DNA檢測、頭顱MRI 檢查。無菌采集腦脊液樣本5 ml于無菌管內(nèi)，全程干冰運輸，-20℃保存，外送至予果生物科技有限公司（西咸新區(qū)予果微碼生物科技有限公司）進行宏基因二代測序。運用PACEseq病原微生物高通量基因檢測，是基于IIUmina 平臺的宏基因組測序技術(shù)，檢測樣本中的全部核酸序列，并與微生物基因組數(shù)據(jù)庫進行比對和分析。

1.3 觀察指標及評價標準

血常規(guī)：白細胞4 ～10×109/L、中性粒細胞百分比40%～70%、淋巴細胞百分比20%～40%，病毒五項陰性，呼吸道病原體聯(lián)檢陰性，顱內(nèi)壓80 ～180 mmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），腦脊液細胞數(shù)0 ～5×106/L，蛋白質(zhì)0.15 ～0.45 g/L，葡萄糖2.5 ～4.5 mmol/L，氯化物120 ～132 mmol/L，腦脊液抗酸染色陰性，墨汁染色陰性，腦脊液結(jié)核DNA 陰性，單純皰疹病毒DNA 陰性。頭顱MRI 檢查結(jié)果、宏基因組二代測序結(jié)果。

1.4 主要儀器及設(shè)備

采用德國羅氏cobas c701、cobas e601 全自動生化分析儀、CT 機為64 排螺旋CT（飛利浦公司），3.0T 核磁共振（荷蘭飛利浦Ingenia）或1.5T 核磁共振（德國西門子公司）。宏基因二代測序是予果生物科技有限公司（西咸新區(qū)予果微碼生物科技有限公司）運用PACEseq 病原微生物高通量基因檢測，基于IIUmina 平臺的測序技術(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料以[n（%）]表示。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

40 例患者，病程3 h 至6 個月，急性起病29 例，亞急性起病5 例，慢性起病6 例。40 例患者臨床表現(xiàn)多樣，其中，頭痛29 例（72.50%）；發(fā)熱22 例（55.00%），體溫波動在38 ～41℃；精神異常8 例（20.00%）；惡心、嘔吐6 例（15.00%）；咳嗽、言語異常、肢體抽搐各3 例（7.50%）；意識障礙、頸部疼痛、腹脹、頭暈、咽痛、肢體無力各2 例（5.00%）；腹痛、腹瀉、吞咽困難各1 例（2.50%）。

2.2 血常規(guī)、病毒五項、呼吸道病原體聯(lián)檢、腦脊液檢測、頭顱影像學檢查結(jié)果

40 例患者，血細胞分析正常26 例（65.00%），異常14 例（35.00%）。中性粒細胞百分比正常10 例（25.00%），增高30 例（75.00%）。淋巴細胞百分比正常8 例（20.00%），增高3 例（7.50%），降低29 例（72.50%）。病毒五項陰性40 例（100.00%）。呼吸道病原體聯(lián)檢陽性1 例（2.50%），流感病毒抗體陽性1 例（2.50%）。腦脊液檢查，顱內(nèi)壓正常27 例（67.50%），增高13 例（32.50%）。細胞數(shù)正常14 例（35.00%），增高26 例（65.00%），波動區(qū)間（8 ～9889）×106/L。其中，淋巴細胞占優(yōu)勢17 例（65.38%），多核細胞占優(yōu)勢9 例（34.62%）。蛋白質(zhì)正常11 例（27.50%），增高29 例（72.50%）。葡萄糖正常25 例（62.50%），增高6 例（15.00%），降低9 例（22.50%）。氯化物正常16 例（40.00%），降低24 例（60.00%）。腦脊液抗酸染色、墨汁染色、結(jié)核DNA、單純皰疹病毒DNA均陰性。頭顱MRI 檢查，16 例（40.00%）頭顱MRI 未見明顯異常。14 例（35.00%）顱內(nèi)散在脫髓鞘；5 例（12.50%）顱內(nèi)多發(fā)缺血灶、腔隙灶；2 例（5.00%）顳葉、丘腦病灶、幕上腦室擴大。1 例（2.50%）雙側(cè)海馬、島葉、胼胝體、枕葉、尾狀核頭病灶。

2.3 宏基因二代測序結(jié)果

本研究腦脊液宏基因二代測序40 例，RNA 檢測14 例，陰性14 例（100.00%）。DNA 檢測40 例，陰性4 例（10.00%），陽性36 例（90.00%）。檢出病毒17 例（42.50%）（表1）。化膿性細菌5 例（12.50%），結(jié)核分枝桿菌復合群2 例（5.00%），真菌2 例（5.00%），罕見病原體10 例（25.00%）。經(jīng)綜合判定，宏基因二代測序假陰性4 例（10.00%），假陽性13 例（32.50%）。

表1 DNA病毒宏基因二代測序結(jié)果

2.4 宏基因二代測序和最終診斷之間的一致性分析

本研究臨床診斷的判定為綜合患者病史、發(fā)病季節(jié)、癥狀體征、臨床特征、各項檢查化驗、宏基因二代測序結(jié)果、對治療的反應和轉(zhuǎn)歸等，分別由2 名主治醫(yī)師和2 名副高及以上醫(yī)師根據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的指南的診斷標準各自進行獨立診斷，最終診斷與宏基因二代測序相應病原體對比分析，對意見不統(tǒng)一的病例進行討論后確定。將臨床診斷的可靠性劃分為4 個等級，確定的、很可能的、可能的、無法判斷的。可能的和無法判斷的患者將被排除。本研究40 例臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，最終全部確診中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，診斷病毒性腦炎23 例，化膿性腦膜炎5 例，流行性乙型腦炎、李斯特腦炎、結(jié)核性腦膜炎各3 例，真菌腦炎、布氏桿菌腦炎、傷寒腦炎各1 例。宏基因二代測序結(jié)果與最終臨床診斷結(jié)果對比分析，宏基因二代測序敏感性為85.19%，假陽性13 例，假陽性率為32.50%，假陰性4 例，假陰性率為10.00%。宏基因二代測序與最終診斷的符合率（表2）。

表2 宏基因二代測序診斷符合率

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，其病原學的診斷主要需要使用腦脊液涂片、病原體培養(yǎng)、抗原抗體檢測、PCR 等相結(jié)合的方法，廣泛且通常為陰性的系列檢測，導致診斷延遲或漏診，早期及時確診病原體，識別和排除傳染性病因，盡量滿足臨床需求是診治中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病過程中遇到的困境。

腦脊液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接接觸，被認為是識別各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要來源，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病原菌診斷中具有重要價值[7]。常規(guī)腦脊液檢查，包括細胞數(shù)的增多程度、分類、蛋白質(zhì)、葡萄糖、氯化物的變化在粗略區(qū)分細菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎方面具有一定的鑒別價值，但同時也存在局限性，部分疾病在腦脊液細胞學的表現(xiàn)重疊，影響了診斷的特異性。對罕見菌感染，亦不能早期發(fā)現(xiàn)，容易延誤治療。

與傳統(tǒng)的方法比較，宏基因組二代測序在檢測細菌、病毒、寄生蟲和真菌感染方面表現(xiàn)出更高的靈敏度，可以最大限度地提高整體診斷性能[8]。研究表明[9]宏基因二代測序雖具有能夠識別范圍廣泛的潛在病原體的優(yōu)勢，但其在病毒性腦炎診斷中的敏感性仍然不如標準的基于擴增的檢測。本研究顯示宏基因二代測序?qū)NA 病毒的診斷符合率為39.13%，但結(jié)合患者綜合信息、宏基因二代測序的病原體特異序列數(shù)和置信度分析，我們發(fā)現(xiàn)病原體特異序列數(shù)與診斷符合率呈正相關(guān)，當其小于10，或存在多種病原體共存時，其診斷符合率低，而當特異性序列大于10，其對DNA 病毒病原體的診斷符合率為100.00%，提示根據(jù)特異性病原體序列數(shù)可輔助判定宏基因二代測序的準確性。另外本研究顯示病毒性腦炎最常見病原體是水痘帶狀皰疹病毒（VZV）、單純皰疹病毒1 型（HSV-1）、EB 病毒（EBV）。與相關(guān)研究一致[10]。

研究報道[11]宏基因二代測序技術(shù)診斷1 例流行性乙型腦炎患者，因高熱、頭痛、意識不清入院，臨床疑診病毒性腦膜腦炎或自身免疫性腦炎，腦脊液表現(xiàn)不典型，根據(jù)典型的頭顱影像學特點懷疑黃病毒感染，行宏基因二代測序最終確診流行性乙型腦炎。本研究宏基因二代測序腦脊液RNA 檢測14 例，全部陰性，其中，3 例流行性乙型腦炎患者，宏基因二代測序均為陰性，診斷符合率為0。結(jié)合患者病史、癥狀體征、發(fā)病季節(jié)及頭顱影像學檢查，高度懷疑流行性乙型腦炎，經(jīng)血清學、腦脊液檢驗流行性乙型腦炎抗體陽性，最終確診。顯示宏基因二代測序技術(shù)對RNA 病毒的敏感性低，可能與RNA 病毒的提取方法、病毒繁殖周期特點及腦脊液采樣時間等有關(guān)。因樣本量少，需后續(xù)追蹤觀察。

研究報道[12]宏基因二代測序?qū)Y(jié)核性腦膜炎診斷的敏感性中等，而特異性高，診斷效果好，可作為結(jié)核性腦膜炎的早期診斷方法。本研究顯示宏基因二代測序?qū)Y(jié)核分枝桿菌診斷符合率為66.67%，與上述研究結(jié)果一致。另有文獻報道[13]宏基因二代測序診斷具有挑戰(zhàn)性的罕見病原體感染的亞急性或慢性腦膜炎病例，包括蛛網(wǎng)膜下腔神經(jīng)囊蟲病、米曲霉菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、都柏林梭菌腦膜炎等。本研究真菌、罕見病原體診斷符合率均達100.00%，其診斷敏感性高，值得臨床推廣應用。提示宏基因二代測序技術(shù)在診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌、真菌及罕見病原體確定方面具有重要價值。

本研究亦存在一些局限性，本研究臨床診斷的確診是結(jié)合患者的病史、發(fā)病季節(jié)、癥狀體征、臨床特征、輔助檢查、宏基因二代測序結(jié)果、對治療的反應和轉(zhuǎn)歸等進行判定，未對宏基因二代測序的結(jié)果進行進一步PCR、病原體培養(yǎng)或一代測序驗證。理論上，宏基因二代測序可用于檢測臨床樣本中的所有病原體，但需排除標本污染、背景菌干擾等情況，存在假陽性、假陰性，需綜合分析判斷。因此，需注意取標本時間，是否處于病毒高峰期，標本的規(guī)范化留取、儲存、轉(zhuǎn)運，同時需改進 DNA/RNA 共提取方法，對DNA 和RNA 進行測序，提取效率、定植與感染的區(qū)分以及方法標準化[14-15]，以提高檢測率。

總之，宏基因二代測序技術(shù)對確定DNA 病毒、細菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌、罕見病原體感染敏感性高，但其對RNA 病毒流行性乙型腦炎病毒的敏感性低。臨床懷疑流行性乙型腦炎時，需謹慎分析宏基因二代測序的結(jié)果，與常規(guī)檢驗方法結(jié)合，綜合判定，以早期診斷，精準治療，改善患者預后。