基于網絡藥理與分子對接探討資生湯治療COPD潛在分子機制

徐雨辰 葉旭星

1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州 310053；2.浙江大學醫學院附屬金華醫院傳統醫學中心，浙江金華 321000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性炎癥性致殘性疾病[1]，發病率和病死率都較高，已成為死亡的主要原因[2]。慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是COPD 進展的關鍵[3]。中醫藥對COPD 具有預防急性加重和治療的積極作用[4]。中醫學將COPD 歸屬于“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇[5]，本虛標實為其主要病理特征。資生湯出自張錫純《醫學衷中參西錄》載：“資生湯主治勞瘵羸弱已甚，飲食減少，喘促咳嗽……。”[6]本方為虛損性疾病而設，從“虛”入手，取“補土生金”之意。研究表明資生湯可以提高COPD 患者免疫功能及生活質量[7]。但其具體有效成分、作用靶點等尚未見有報道。因此，本研究采用網絡藥理學及分子對接方法探討資生湯治療COPD 的潛在分子機制，為臨床提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資生湯有效成分提取

將資生湯藥物組成“山藥、白術、玄參、牛蒡子”4 味中藥（雞內金由于非草本類藥物無數據資料，故不納入）分別輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP（traditional chinesemedicine systems pharmacology，https://tcm-spw.com /tcmsp.php），將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）設置為≥50%及藥物相似性（drug-likenes，DL）設置為≥0.20，最終合并以獲得活性成分數據集。

1.2 資生湯藥物作用靶點挖掘

同樣利用TCMSP 數據庫收集資生湯有效活性成分對應的作用靶點，然后運用UniProt（https://www.uniprot.org/）數據庫進行作用靶點匹配及基因名標準化處理以用于網絡結構分析。

1.3 資生湯治療COPD的潛在作用靶點篩選

以“COPD”作為搜索條件輸入GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫，收集得到慢性阻塞性肺疾病靶點。運用Venn 圖在線工具（https://www.bioinformatics.com.cn/）提取疾病靶點和藥物作用靶點的交集，即得到資生湯治療COPD 的潛在作用靶點。

1.4 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

將資生湯治療COPD 潛在作用靶點數據集上傳至String 數據庫（https://string-db.org/），導出蛋白質相互作用網絡數據信息。再利用Cytoscape 3.8.2軟件構建PPI 網絡圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

利用David 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），對潛在作用靶點進行基因本體和通路富集分析，并進行數據可視化處理。

1.6 分子對接

從TCMSP 數據庫下載資生湯有效成分分子式作為配體，從PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載關鍵靶點蛋白，去除水分子及配體，作為受體。運用AutoDock Vina 1.2.3 軟件對篩選所得的配體及受體逐個進行批量分子對接以驗證結合能力。

2 結果

2.1 資生湯活性成分

運用TCMSP 數據庫，將篩選條件設為OB ≥50%且DL ≥0.20，共獲得8 個活性成分，見表1。

表1 資生湯主要有效成分及來源

2.2 資生湯治療COPD潛在作用靶點

通過TCMSP 數據庫搜集目標中藥活性成分對應作用靶點78 個。通過比對Genecards 數據庫中COPD 疾病靶點集，最后得到17 個資生湯治療COPD 的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 資生湯治療COPD 的潛在作用靶點

2.3 “中藥-成分-作用靶點”網絡圖

將上述篩選得到的中藥、有效成分及作用靶點整理得到三者相互對應的數據信息，并導入至Cytoscape 3. 8.2 軟件生成“中藥- 成分- 作用靶點”網絡圖，得到1 個90 個節點，97 條邊的網絡，見圖2。

圖2 中藥-成分-作用靶點網絡圖

2.4 PPI網絡結構

將篩選得到的17 個潛在作用靶點，上傳至STRING 數據庫，得到PPI 網絡數據信息。再利用Cytoscape 3.8. 2 軟件構建PPI 網絡圖，見圖3。對網絡結構進行拓撲分析，得到各靶點的介度（Betweenness centrality）、緊密度（Closeness centrality）和度（Degree）。以介度、緊密度大于中位數和度大于兩倍中位數進行篩選共得到9 個核心靶點，見表2。

圖3 資生湯潛在作用靶點PPI 網絡

表2 9個核心靶點拓撲學性質

2.5 GO和KEGG分析

利用David 6. 8 數據庫進行GO 分析，共得到88 個條目，其中生物過程（biological process，BP）72 個條目，主要涉及細胞凋亡過程和DNA 的轉錄正調控、一氧化氮生物合成過程正調控等方面；細胞組成（cellular component，CC）8 個條目，主要涉及質膜外側、溶酶體、胞外區等方面；分子功能（molecular function，MF）8 個條目，主要涉及細胞因子活性等。各取P≤0.01 且排名前8 條目進行可視化作圖，見圖4。

圖4 資生湯治療COPD 潛在靶點GO 功能分析

KEGG 信號通路富集共獲得8 條通路，見圖5。通路主要涉及Toll 樣受體信號通路（tolllike receptor signaling pathway）、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis）、移植物抗宿主病（graftversus-host disease）等。

圖5 資生湯治療COPD 潛在靶點KEGG 通路分析

2.6 分子結合能力驗證

炎癥反應是COPD 發生、發展的核心。因此，我們從以上篩選出的9 個核心靶點中選取白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）3 個炎癥靶點作為受體與資生湯中8 個有效成分進行分子對接。結果顯示8 種有效成分與IL-6、IL-1β、TNF 的Vina affinity 得分均小于-5.0 kcal/mol，提示均有較好的結合能力，見圖6。

圖6 資生湯有效成分與炎性靶點對接結果（affinity 得分 kcal/mol）

3 討論

本研究借助網絡藥理學與分子對接方法來探究資生湯治療COPD 的物質基礎及分子機制。資生湯主要活性成分有惡唑烷-2-酮、紫杉醇、海風藤酮、山酮 C、薯蕷皂苷元、3β-乙酰氧基白術酮、14-去氧-12 （R）-磺酸基穿心蓮內酯、玄參苷8 種，涉及IL-6、IL-1β、TNF 等與炎癥相關的主要靶點。分子對接結果提示8 種有效成分與以上3 種炎癥靶點均具有較好的結合能力。

環境因素與多基因變異的相互作用是COPD發病的關鍵。目前認為COPD 的發病機制與炎癥反應、氧化和抗氧化失衡、氣道高反應和主動防御等炎癥免疫機制密切相關[8]。然而炎癥是COPD發展的中心環節，炎癥細胞釋放炎性介質和破壞性酶，參與了COPD 肺實質的進行性破壞[9]，并與肺動脈高壓發生、發展和預后有著至關重要的聯系。IL-6、IL-1β、TNF-α 均能參與COPD 的炎癥反應，是介導機體炎癥反應的重要細胞因子[10]。IL-6 不僅能激發T 淋巴細胞、B 淋巴細胞分泌炎癥介質，促進B 淋巴細胞分化成熟，趨化中性細粒細胞和單核-巨噬細胞，還能增強IL-1β、TNF-α 炎癥效應[11]。IL-1β 在氣道上皮細胞及肺泡巨噬細胞中發揮作用，又能上調IL-6 表達水平，從而形成IL-6 與IL-1β 互相激發的惡性循環不斷放大炎癥反應，加重肺部損傷[12]。TNF-α 作為一種重要的促炎細胞因子，在COPD 發展過程中也起著至關重要的作用[13]。研究證實TNF-α 過表達與氣流阻塞的程度、肌肉功能障礙密切相關[14]。從KEGG 信號通路分析來看，資生湯可能通過Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路來發揮治療作用。目前，已有多項研究表明TLR4 與COPD 的發病密切相關[15]。

綜上所述，資生湯可能通過8 種不同活性成分共同作用，抑制TLR 信號通路，下調IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子水平，減輕炎癥，阻斷肺血管重塑，從而達到治療COPD 的目的。