敲低WTAP表達(dá)抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

劉 禎 趙海洋 吳環(huán)立 李琳坤

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，大約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%。在膠質(zhì)瘤中，一半以上為惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，以快速侵襲生長(zhǎng)和反復(fù)復(fù)發(fā)為特點(diǎn)，臨床預(yù)后極差[1]。同其他惡性腫瘤一樣，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤存在異質(zhì)性，其中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）是膠質(zhì)瘤起始和復(fù)發(fā)的來(lái)源，也是膠質(zhì)瘤侵襲生長(zhǎng)和對(duì)放化療抵抗的重要原因[2]。研究顯示，GSC 是膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵，只有針對(duì)GSC 的治療方法才能有效遏制膠質(zhì)瘤的 生 長(zhǎng)[3]。Wilms 腫 瘤 抑 制 因 子（Wilms tumor suppressor factor，WTAP）是一種在人體內(nèi)廣泛表達(dá)的核蛋白。有研究顯示W(wǎng)TAP在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)且能通過(guò)調(diào)控AKT 通路來(lái)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲[4]。本文探討敲低WTAP表達(dá)對(duì)GSC增殖、遷移和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 GSC 分離及鑒定術(shù)中獲得膠質(zhì)瘤標(biāo)本后，將標(biāo)本組織盡可能剪碎至形成懸濁液，然后300 g 離心5 min，取沉淀并用5 ml 已活化的木瓜蛋白酶溶液（生工生物工程有限公司）重懸，混勻后37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 min，每10 min 取出重懸混勻1 次，消化完畢后過(guò)40 μm 濾膜，取過(guò)濾液300 g 離心5 min，GSC 培養(yǎng)基重懸沉淀后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。GCS培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，由DMEM/F12（美國(guó)Gibco公司）中加入1%N2（美國(guó)Gibco 公司）、2%B27（美國(guó)Gibco 公司）、0.04%EGF（美國(guó)Invitrogen 公司）、0.02%FGF2（美國(guó)Invitrogen 公司）配置，GSC 貼壁培養(yǎng)時(shí)需預(yù)先應(yīng)用laminin（美國(guó)Sigma 公司）包被培養(yǎng)皿。應(yīng)用定量PCR 檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2 的表達(dá)量，通過(guò)加入TGF-β促進(jìn)分化后檢測(cè)其SOX2、血管周細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA和PDGFRb 的表達(dá)檢測(cè)其分化能力。HU?VEC 細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，并使用該公司提供培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)應(yīng)用lipofectamine2000（美國(guó)Invitro?gen 公司）將WTAP shRNA 和陰性對(duì)照shRNA（由武漢金開(kāi)瑞生物有限公司提供）轉(zhuǎn)染GSC。將GSC 接種24 孔板（5×104個(gè)/孔），培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，應(yīng)用50 μl無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋0.5 μg的質(zhì)粒和1 μl的li?pofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑，將兩者充分混勻后分散滴加到細(xì)胞中，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)量應(yīng)用RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系（日本Takara公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green I 嵌合熒光法（美國(guó)Bio-rad 公司）進(jìn)行熒光定量分析，以β-actin 為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：內(nèi)參β-actin 正義鏈5'-CTCTTCCAGCCTTCC TTCCT- 3'，5'- AGCACTGTGTTGGCGTACAG- 3'；WTAP 正義鏈5'-GCCAACTGCTGGCGTGTCT-3'，反義鏈5'-ATGGCGAAGTGTCGAATGCT-3'；SOX2 正義 鏈5'-CACAACTCGGAGATCAGCAA-3'，反 義 鏈5'-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3'；α-SMA 正義鏈5'- CAATGAGCTTCGTGTTGCCC- 3'，反 義 鏈5'-GCAAGGCATAGCCCTCATAGA-3'；PDGFRb 正義鏈5'-GCTGTTACCCACTCTGGGAC-3'，反義鏈5'-TG?GTGTCCTTGCTGCTGATG-3'。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將GSC 接種96孔板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基100 μl每孔，培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后加入5 μl MTT（5 mg/ml）培養(yǎng)4 h，加入100 μl 裂解液、37 ℃裂解4 h，測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處吸光度。

1.5 細(xì)胞侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Transwell 小室（美國(guó)Corning公司，8 μm膜）檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力，小室下層提前鋪入HUVEC細(xì)胞以誘導(dǎo)GSC遷移，遷移實(shí)驗(yàn)直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，侵襲實(shí)驗(yàn)上下兩層小室之間鋪基質(zhì)膠（美國(guó)Corning公司），培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的底部細(xì)胞進(jìn)行DAPI 染色計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)間為24 h，侵襲實(shí)驗(yàn)為3 d。

1.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)收取待測(cè)定細(xì)胞六孔板，吸出培養(yǎng)基并用PBS 洗滌后每孔加入200 μl RIPA 裂解液（北京Biosharp 公司）裂解，超聲裂解細(xì)胞后10 000轉(zhuǎn)/min 離心10 min，離心溫度4 ℃，取上清液應(yīng)用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液配置為蛋白樣本，100 ℃煮10 min，行SDS-PAGE 電泳（恒壓電泳80 V、30 min，之后120 V），電泳分離滿意后200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2～4 h 后顯影分析。應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。內(nèi)參GAPDH 抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（1:100 000），AKT 抗體（1:1 000）及pAKT 抗體（1:2 000）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（1:5 000）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析；計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 GSC的鑒定GSC高表達(dá)干性標(biāo)記物并具備一定條件下分化的能力。GSC 完全培養(yǎng)基和用TGFβ替換EGF 和FGF 的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)GSC，兩種培養(yǎng)條件下GSC的SOX2、α-SMA和PDGFRb mRNA表達(dá)量均有顯著差異（P<0.001）。膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本中提取的腫瘤細(xì)胞在GSC 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2，證實(shí)這些細(xì)胞具備GSC的“干性”。將培養(yǎng)基中EGF、FGF2替換為T(mén)GFβ，發(fā)現(xiàn)其干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2的表達(dá)量明顯下降，而血管周細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA 和PDGFRb 的表達(dá)量顯著上調(diào)（圖1），證實(shí)這些細(xì)胞具有分化為其他細(xì)胞的潛能。以上結(jié)果說(shuō)明這些膠質(zhì)瘤細(xì)胞具備GSC 的特征，可滿足GSC 的實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 GSC 完全培養(yǎng)基（DMED/F12+EGF+FGF2）和用TGFβ替換EGF和FGF的培養(yǎng)基（DMEM/F12+TGFβ）培養(yǎng)進(jìn)行鑒定GSC

2.2 WTAP 敲低效率的檢測(cè)與陰性對(duì)照shRNA 相比，轉(zhuǎn)染W(wǎng)TAP shRNA 質(zhì)粒的GSC 中WTAP mRNA表達(dá)量顯著下降（P<0.05；圖2）。

圖2 GSC中WTAP敲低效率檢測(cè)結(jié)果

2.3 敲低WTAP 表達(dá)對(duì)GSC 增殖的影響與陰性對(duì)照shRNA相比，轉(zhuǎn)染W(wǎng)TAP shRNA質(zhì)粒后，GSC的增殖、侵襲、遷移能力均顯著下降（P<0.05；圖3、4）。

圖3 敲低WTAP表達(dá)顯著抑制GSC的增殖

圖4 敲低WTAP顯著抑制GSC的遷移和侵襲

2.4 敲低WTAP表達(dá)對(duì)GSC中AKT磷酸化水平的影響與陰性對(duì)照shRNA 相比，轉(zhuǎn)染W(wǎng)TAP shRNA 質(zhì)粒后，pAKT/AKT比值顯著下降（P<0.05；圖5）。

圖5 敲低WTAP抑制GSC中AKT磷酸化的水平

3 討論

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，高級(jí)別膠質(zhì)瘤以生長(zhǎng)迅速、侵襲性強(qiáng)和反復(fù)復(fù)發(fā)為臨床特點(diǎn)，臨床預(yù)后極差，是臨床上亟待解決的難題。GSC 被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵，其主要特征是能夠高表達(dá)干細(xì)胞生物標(biāo)記物，可以自我更新并具備分化能力。有研究顯示W(wǎng)TAP在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可以調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)直腸癌的發(fā)生發(fā)展；通過(guò)結(jié)合CDK2 轉(zhuǎn)錄本促進(jìn)腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖；促進(jìn)彌漫大B 淋巴瘤細(xì)胞的增殖并降低其化療效果[5，6]。有研究對(duì)WTAP在膠質(zhì)瘤普通細(xì)胞系增殖和遷移中的作用進(jìn)行探究，結(jié)果顯示敲低WTAP 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖和遷移，值得注意的是，在10%胎牛血清的培養(yǎng)條件下敲低WTAP 可以抑制U87 細(xì)胞增殖，但對(duì)膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞的增殖無(wú)影響，在1%胎牛血清的條件下敲低WTAP，明顯抑制U87細(xì)胞和原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[4]。本研究GSC 是在無(wú)血清調(diào)節(jié)下培養(yǎng)的，敲低WTAP表達(dá)后增殖受到明顯抑制。由于無(wú)血清培養(yǎng)是維持GSC 干性的必要條件，無(wú)法驗(yàn)證培養(yǎng)基胎牛血清濃度與WTAP 對(duì)GSC 增殖影響之間的關(guān)系，另一方面，這種差異也可能是由于該項(xiàng)研究中提取的原代細(xì)胞的異質(zhì)性導(dǎo)致。

有研究顯示W(wǎng)TAP可能通過(guò)調(diào)控AKT通路抑制卵巢癌細(xì)胞和膠質(zhì)瘤普通細(xì)胞系的增殖和遷移[4，7]。AKT 信號(hào)通路是影響腫瘤增殖和遷移的經(jīng)典通路，在GSC 的自我更新、遷移和成瘤能力等多方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[8，9]。本研究觀察到敲低WTAP表達(dá)后GSC的AKT磷酸化水平明顯降低。

總之，WTAP 在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，敲低WTAP 表達(dá)顯著抑制GSC的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與調(diào)控AKT磷酸化水平有關(guān)。