云南耿馬甘蔗宿根矮化病的發生分布和病原分子檢測

馬永德，王曉燕，李銀煳，李 婕，張榮躍，單紅麗，黃應昆

(1耿馬縣農業農村局，云南耿馬 677500；2云南省農業科學院甘蔗研究所，云南開遠 661699)

0 引言

耿馬地處云南省西南部，縣域內冬無嚴寒、夏無酷暑、雨熱同季、日照充足、晝夜溫差大，有利于甘蔗生長和蔗糖分積累，是中國糖料蔗核心基地縣之一，也是云南省甘蔗產業“一縣一業”特色縣。2021年耿馬甘蔗種植面積2.71萬hm2，涉及全縣47個村民委員會、1個社區和15個農場生產隊，種蔗農戶達2.25萬戶10萬余人，蔗糖產業已成為云南耿馬邊疆民族地區“脫貧攻堅、鄉村振興”支柱產業，其在促進邊疆地區經濟發展、農民增收和助力鄉村振興中發揮著重要作用。

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)是由一種寄生在蔗株維管束中的棒桿菌屬細菌(Leifsonia xylisubsp.xyli，Lxx)引起的世界性種傳病害[1-7]，造成甘蔗宿根年限縮短、種性退化，嚴重影響甘蔗產量和品質。據調查，受害蔗田一般減產10%～30%[8-12]，干旱缺水時達60%以上，蔗糖分降低0.5%，宿根年限縮短1～2年，每年可造成上億元的經濟損失，嚴重阻礙了蔗糖產業的高質量發展[13]。國內外研究結果表明，防治RSD最經濟有效的措施是種植溫水脫毒健康種苗[9,14-15]，此方法對甘蔗具有顯著的增產增糖效果，新植蔗增產5.01～49.83 t/hm2；宿根蔗增產4.41～30.84 t/hm2，蔗糖分提高0.35%～0.86%，宿根年限延長2～3年[16-19]。耿馬作為云南省甘蔗產業“一縣一業”特色縣，也是今后甘蔗生產重點布局和最具潛力的發展區域，由于多年均未對RSD在耿馬各主產鄉鎮的分布、發生危害和品種感病程度等進行系統全面調查，致使推廣應用溫水脫毒健康種苗、有效防控RSD缺乏可靠依據。為此筆者于2022年對云南耿馬不同蔗區的RSD發生危害情況進行了系統調查和病原分子檢測，分析明確了云南耿馬不同蔗區、不同品種、不同植期RSD的發生狀況，為甘蔗溫水脫毒健康種苗的生產繁殖和推廣應用及有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查與樣品采集

于2022年12月甘蔗成熟期，對云南耿馬縣耿馬鎮、賀派鄉和四排山鄉等主產蔗區宿根矮化病的發生和分布進行了調查和田間采樣。采樣選擇具有代表性的主栽或主推品種，根據品種、蔗地、植期分類，隨機取樣，共采集80個樣本。其中耿馬鎮采集了29個樣本，賀派鄉采集了30個樣本，四排山鄉采集了21個樣本。品種上，采集了22個粵糖93-159樣本，8個新臺糖22號樣本，9個柳城05-136樣本，8個盈育91-59樣本，6個粵糖83-88樣本，4個云瑞06-189樣本，4個云瑞07-1433樣本，3個云瑞10-328樣本，7個云蔗05-51樣本，9個云蔗08-1609樣本。植期上，采集了1年植期樣本10個，2年植期樣本17個，3年植期樣本24個，4年植期樣本25個，5年植期樣本3個和7年植期樣本1個。

每個樣本取10株，每株截取中下部莖節各1節，每節切成約7 cm長，縱向“十”字剖為4份，再用鉗子擠壓蔗莖，共取約25 mL的蔗汁于50 mL離心管內混勻，樣品放于冰箱中，于-20℃保存待用。每取1個樣品后，取樣工具先用清水沖洗，再用75%酒精進行消毒。RSD陽性對照由云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室鑒定保存，陰性對照為(50±0.5)℃熱水處理2 h的無菌蔗株，空白對照為滅菌去離子水。

1.2 蔗汁總DNA的提取

各樣品取4 mL蔗汁，12000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀采用北京全式金生物技術有限公司的EasyPure Plant Genomic DNA Kit試劑盒提取蔗汁總DNA，具體步驟參照說明書進行操作。

1.3 RSD分子檢測

RSD的PCR分子檢測采用Pan等[20]反應體系及擴增程序，即PCR擴增體系20 μL：ddH2O 8.6 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 8 μL(北京全式金生物技術有限公司，AS111-11)，DNA模板3 μL，上下游引物各0.2 μL(20 μg/μL)；擴增程序為：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環后72℃延伸5 min。Lxx特異性引物Lxxl：5’-CCGAAGTGAGCAGATTGACC- 3’和Lxx2：5’-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3’，預期擴增片段大小438 bp，委托上海生工生物工程有限公司合成。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 各主產鄉鎮RSD發生情況

對云南耿馬縣耿馬鎮、賀派鄉和四排山鄉等3個甘蔗主產鄉鎮宿根矮化病的調查和檢測結果表明見表1、圖1。耿馬蔗區RSD發生普遍。采用RCR法對采集的80個樣本進行RSD檢測，結果一致。80個樣本中61個呈陽性，陽性檢出率為76.25%；其中強陽性樣本34個，占42.50%；3個甘蔗主產鄉鎮均檢測出RSD，陽性檢出率在70.00%～85.71%之間，檢出率和強陽性率最高的是四排山鄉，分別為85.71%和66.67%；其次是耿馬鎮、賀派鄉，檢出率為75.86%、70.00%，強陽性率為31.03%、36.67%(見圖2)。

圖1 云南耿馬甘蔗宿根矮化病(RSD)PCR檢測電泳圖

圖2 各主產鄉鎮甘蔗宿根矮化病發生情況

表1 云南耿馬甘蔗宿根矮化病(RSD)檢測結果

2.2 不同品種、植期RSD發生情況

從檢測結果看，耿馬蔗區粵糖93-159、新臺糖22號、粵糖83-88、柳城05-136、盈育91-59、云瑞06-189、云瑞07-1433、云瑞10-328、云蔗05-51、云蔗08-1609等10個主栽或主推品種均發病，發病率在37.50%～100%之間，其中尤以粵糖93-159、粵糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136發病最重，發病率為77.27%～100%，強陽性率為44.44%～66.67%，其次是新臺糖22號、云瑞06-189、云瑞10-328、云蔗05-51和云蔗08-1609，發病率為37.5%～100%，強陽性率為0%～14.29%(見圖3)。植期上1、2、3、4、5年均不同程度發病，但幾者之間發病率和發病程度都沒有明顯的規律性差異(見圖4)。

圖3 不同甘蔗品種宿根矮化病發生情況

圖4 不同植期宿根矮化病發生情況

3 小結與討論

3.1 RSD在云南耿馬蔗區普遍發生且危害嚴重

田間隨機采樣檢測結果表明，地域上，耿馬鎮、賀派鄉和四排山鄉等甘蔗主產鄉鎮都檢測出RSD，陽性檢出率為70.00%～85.71%，強陽性率為31.03%～66.67%；80個供試樣本中61個呈陽性，陽性檢出率為76.25%；其中強陽性樣品34個，占42.50%。品種上，10個主栽或主推品種的RSD陽性檢出率為37.5%～100%，強陽性率為14.28%～66.67%。植期上，1、2、3、4、5年均不同程度發病，陽性檢出率為60.00%～91.67%，強陽性率為30.00%～52.94%。由此可見，RSD已在云南耿馬蔗區普遍發生且危害嚴重。

3.2 科學布局溫水脫毒健康種苗示范基地

耿馬全縣境內甘蔗種植面積近2.67萬hm2，是云南省甘蔗種植面積最大的縣。甘蔗種植區覆蓋面廣，蔗糖產業是耿馬關聯度最大、涉及面最廣、影響最深的重要支柱產業，也是全縣經濟發展的一張王牌。本文研究結果表明，RSD在耿馬蔗區普遍發生、危害嚴重，現已成為制約耿馬蔗糖產業持續高質量發展、蔗農增產增收和鄉村振興的重大問題。國內外研究結果表明，種植溫水脫毒健康種苗, 甘蔗出苗快，分蘗強，株高高，蔗莖粗，新植蔗增產5.01～49.83 t/hm2，宿根蔗增產4.41～30.84 t/hm2，蔗糖分提高0.35%～0.86%，是防治RSD最經濟有效的措施[15-19]。因此，在耿馬蔗區生產和推廣應用溫水脫毒種苗是有效防治甘蔗病害，特別是RSD傳播，提高甘蔗產量、延長宿根年限最具潛力和效能的重要措施。根據RSD檢測結果，耿馬蔗區應重點加強粵糖93-159、粵糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136等易感病品種的溫水脫毒種苗生產繁殖和推廣應用。同時建立規范化、標準化的甘蔗溫水脫毒健康種苗一級種苗圃133.33 hm2，二級種苗圃1333.33 hm2，以進行種苗擴繁，提供每年近6666.67 hm2的脫毒種苗供生產種植。一級種苗圃專用于繁育經溫水處理的脫毒種苗，宜選擇與糖廠相鄰近，交通便利、排灌方便，地勢平坦，地塊土質、肥力均較好的田塊。脫毒種苗擺放1～2天待胚芽硬化后種植(不超過5天)，下種量為120000～150000芽/hm2，雙行接頂擺放(與當地常規種植方式相同)。一級苗圃需強化病蟲害綜合防治，各項操作應由經過培訓技術人員擔任。在耿馬各甘蔗主產鄉鎮規劃建立甘蔗溫水脫毒種苗基地二級種苗圃，二級苗圃大量繁育從一級苗圃收獲的蔗種，從下種開始直至收獲，都應由專業種植大戶加強田間管理，專業技術人員定期巡查指導病蟲害防治。二級苗圃收獲的蔗種即為生產用脫毒種苗，提供蔗農種植。溫水脫毒種苗一、二級專用種苗圃擴繁，田間管理按當地生產實際；全程注重病蟲監測、種苗純度檢測，種苗砍收、種植全過程，所用工具應經75%酒精液消毒。