PDT通過氧化應激增加TMZ對膠質瘤U251細胞的抑制

侯魁元 鄧賀民 劉建勇 蘇 穎 王偉君 曲 藝 王丹丹 焦 樂

膠質瘤是中樞神經系統的惡性腫瘤,盡管手術加術后放化療技術的提高,但是其預后差,治療效果仍不令人滿意[1]。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是公認的膠質瘤臨床一線化療藥物,在細胞中TMZ通過破壞DNA和誘發程序性細胞死亡發揮抗腫瘤作用,具體在鳥嘌呤的N7和O6位點以及腺嘌呤的N3位置對膠質瘤細胞基因組DNA進行烷基化,并在隨后的復制周期中誘導核苷酸錯配及細胞DNA修復失效,并促進細胞周期在G2/M期阻滯,導致膠質瘤細胞死亡[2]。但是多重耐藥性(multiple drug resistance,MDR)在TMZ治療過程中仍不可避免發生,文獻報道對膠質瘤患者,TMZ的MDR發生率高達50%左右,成為膠質瘤局部侵襲、復發和預后不佳的重要原因[3]。TMZ耐藥除了O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶、錯配修復(mismatch repair,MMR)堿基切除修復(base excision repair,BER)等DNA修復機制介導外,生存自噬、MicroRNA、膜的離子泵、膠質瘤細胞干性等都參與了TMZ耐藥的發生[4]。如何降低或延緩MDR在TMZ應用中的發生,提高TMZ療效成為目前急于解決的重要臨床問題。

目前根據文獻報道,TMZ與其他抗腫瘤藥物/療法結合應用已成為治療膠質瘤的主要策略之一,用以抵抗MDR的發生[5]。聯合治療的基本原理是使用通過靶向和TMZ不同藥理機制的其他關鍵分子或通路,如調控FOXM1-survivin軸、PI3K/Akt信號通路的活性,從而增加TMZ的療效,降低膠質瘤細胞MDR的發生[6]。PDT是目前治療腫瘤的新興手段,主要機制通過光照激活光敏劑后產生具有生物活性的ROS,主要有超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)等,ROS產生氧化應激,導致腫瘤細胞壞死、滋養血管閉塞、免疫反應等,在膠質瘤治療中顯示了廣闊的前景[7, 8]。既往研究表明,PDT可以促進TMZ對大鼠C6膠質瘤細胞的抑制和殺傷效應[9]。本研究旨在進一步觀察研究PDT是否能提高TMZ作用后的人源的膠質瘤U251細胞內ROS總量,從而增加腫瘤細胞對TMZ的敏感度。

材料與方法

1.試劑和材料:膠質瘤細胞U251由黑龍江省北方轉化醫學中心獲得,高糖培養基DMEM購自美國HyClone公司,胎牛血清(foetal bovine serum,FBS),購自美國BI公司,光敏劑5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid, 5-ALA) 購自美國Sigma公司,用無血清培養基將其溶解為 0.4mmol/L于 4℃保存。CCK-8 kit 試劑盒購自日本Dojindo公司,ROS探針購自上海碧云天生物技術有限公司,MMP檢測試劑盒購自美國Proteintech公司, 細胞培養板和培養瓶購自無錫耐思生物科技有限公司。

2.細胞培養:膠質瘤細胞U251用含10% FBS加1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM的培養基,置于5% CO2、37℃的培養箱中培養,對數期的生長細胞用于后續實驗。

3.細胞分組及處理:取上述對數生長期的膠質瘤細胞,胰酶常規消化后鋪在培養板中(依據實驗內容采用96或6孔板)繼續培養。根據處理因素不同,細胞分為5組,即對照(control)組(無特殊處理),TMZ組(TMZ 80μmol/L),PDT組 (5-ALA 0.4mmol/L,0.5J/cm2,激光波長635nm), TMZ+Laser組(TMZ 80μmol/L, Laser 0.5J/cm2,波長635nm),TMZ+PDT組(TMZ 80μmol/L, Laser 0.5J/cm2,5-ALA 0.4mmol/L,波長635nm)。PDT過程:5-ALA 孵育4h,用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 清洗3次后加入DMEM, 激光照射(能量密度0.5J/cm2,照射波長 635nm),全程避光操作。

4.細胞活性檢測:將上述細胞分組及處理后的各組細胞接種于96孔板,分別在不同時間點(4、8、12、16、24h),每孔加入 CCK-8溶液10微升/孔,同時設復孔,37℃培養箱孵育1h,酶標儀測定(波長450nm)光密度(OD)值。

5.侵襲實驗:Transwell小室(8.0μm)的上室加入細胞分組及處理后的含無血清DMEM的膠質瘤細胞(1×105個/毫升)200μl,下室(24孔板)填充500μl含有10%血清的DMEM,注意排凈下室的氣泡,37℃培養24h;擦除小室內壁的細胞,晾干,放入95%乙醇中固定5min,磷酸鹽緩沖液慢洗3次,室溫下晾干,結晶紫(0.4%,800微升/孔)染色30min,純凈水淋洗,倒置顯微鏡觀察穿透細胞個數。

6.細胞內ROS檢測:處理后的細胞去除培養液,加載DCFH-DA工作液(無血清 DMEM 稀釋至1∶1000)覆蓋,量以充分覆蓋細胞即可,37℃培養箱內培養20min,用無血清DMEM輕輕洗滌3次,DAPI(1∶50)復染 15min,PBS洗3min,熒光顯微鏡下(488nm/525nm檢測波長)檢測DCF熒光。

7.線粒體膜電位MMP檢測:按上述各組處理后的細胞,按說明書使用,采用線粒體tracker (50nmol) 染色 30min,PBS洗滌3次,充分去除未進入細胞內的熒光染料。活細胞工作站檢測,熒光數據用Image pro Plus軟件分析。

結 果

1.細胞活力的影響:如圖1所示,CCK-8實驗表明在TMZ處理后的4～8h,細胞OD值(細胞活力)下降,8h后,細胞OD值有升高的趨勢,即產生了膠質瘤細胞對TMZ的治療抵抗。筆者前期檢測了不同劑量PDT對U251的影響,當0.5J/cm2時對膠質瘤細胞僅有輕度抑制,因此選用此劑量用于后續實驗。圖2表明,當PDT協同應用于TMZ處理8h的U251細胞后,PDT+TMZ組OD值最低(0.7242±0.0886),與TMZ組(0.9379±0.1189)比較差異有統計學意義(P<0.01),與control組(1.164±0.1309)比較,差異有統計學意義(P<0.001),說明PDT明顯提高了TMZ對膠質瘤細胞的抑制作用,延緩了MDR的發生。

圖1 TMZ作用后 U251細胞活力變化

圖2 不同組別U251細胞活力比較*P<0.01,**P<0.001

2.細胞侵襲:利用Transwell小室進一步觀察PDT能否提高U251的侵襲抑制(圖3)。TMZ+PDT

圖3 不同組別 U251細胞侵襲能力變化(結晶紫染色,×100)

組侵襲的細胞分別與control組(3313±377.9)比較,差異有統計學意義(P<0.001),與TMZ組(2023±547.4)比較,差異有統計學意義(P<0.05,圖4)。表明PDT存在下,提高了TMZ對膠質瘤細胞U251的侵襲抑制。

圖4 不同組別 U251細胞侵襲數量比較*P<0.05,**P<0.001

3.ROS表達: PDT+TMZ組的ROS水平(6637±2317)高于control組(2734±1584,P<0.001)和TMZ組(4433±2333,P<0.01)。說明在PDT協同下,TMZ增加了U251細胞內源性ROS的水平,提高了細胞內氧化應激能力(圖5)。

圖5 不同組別的U251細胞內ROS水平*P<0.01,**P<0.001

4.細胞內MMP水平:MMP是細胞凋亡的早期標志,本研究中PDT+TMZ組MMP水平(10454±1831)分別低于TMZ組(22037±5138,P<0.01)和control組(32076±9374,P<0.001),進一步分析表明,ROS 與MMP水平呈負相關(r=-0.559,P<0.05)。表明協同治療通過提高細胞內ROS水平后轉向了加速膠質瘤細胞的凋亡的過程,從而延緩MDR的發生(圖6～圖8)。

圖6 U251細胞MMP變化(×100)A.線粒體tracker;B.光鏡

圖7 不同處理后 U251細胞MMP比較*P<0.01,**P<0.001

圖8 細胞內ROS與MMP水平關系

討 論

TMZ和其他常規化療藥物通過破壞腫瘤細胞DNA和誘發程序性細胞死亡在細胞中發揮抗腫瘤作用。雖然TMZ臨床研究取得了令人興奮的結果,為提高膠質瘤療效帶來了新的曙光,但是膠質瘤的延遲進展及腫瘤MDR對TMZ療效的限制并沒有轉化為患者整體生存期的延長[10]。聯合治療有可能成為改善膠質瘤預后的重要措施之一[11]。如將TMZ與蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)、阿帕替尼、貝伐單抗等低分子物質連用,可提高TMZ的療效,但是很多抗腫瘤藥物都有一定的毒性不良反應,如血小板計數減少、嘔吐、轉氨酶升高、腎功能異常等[12, 13]。而PDT過程中,光敏劑只在局部激活,治療反應僅發生于光照區域,正常組織毒性低、無交叉耐藥等特點,較傳統化療藥物有獨特優勢。

本研究發現,TMZ作用于人源膠質瘤U251細胞可使細胞活力短暫下降8h,但是隨著時間的進行,8h后細胞出現明顯的耐受,導致細胞活性開始逐漸恢復,即明顯的TMZ治療抵抗現象。但是聯合PDT(0.5J/cm2)后,卻明顯增加了TMZ對U251細胞的毒性作用,抑制了U251細胞對TMZ的耐藥。上述實驗結果明確了U251細胞對TMZ耐受的臨界時間點和PDT增加TMZ細胞毒性的增敏效應。研究表明,PDT能增加U251細胞對TMZ的敏感度提高其細胞毒性作用。侵襲和遷移是惡性腫瘤的重要生物學行為,進一步利用Transwell小室研究表明,PDT+TMZ能明顯抑制U251的侵襲,與單獨TMZ和對照組比較,這些結果表明PDT不僅提高了TMZ對U251細胞的增殖抑制,也抑制了細胞的局部侵襲發生。國內其他相關研究也得到了類似的結果,徐文虎等[14]研究發現香葉木苷能通過核因子κB(nuclear factor kappa-B(NF-κB)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路增強替莫唑胺對大鼠神經膠質瘤細胞C6增殖、侵襲和上皮間質轉化的抑制作用。總之,利用避免具有交叉抗性的藥物或療法可以增強TMZ抑制膠質瘤細胞的療效,延緩MDR的發生,本研究為提高膠質瘤細胞對TMZ的敏感度提供了新的實驗方案。

TMZ的藥理作用是通過甲基化腫瘤細胞DNA,使DNA修復障礙,導致細胞死亡,此外Lo Dico等[15]研究表明氧化應激也參與了其藥理機制, TMZ與線粒體ROS清除劑聯合使用在U251敏感細胞中,通過抑制線粒體ROS釋放,削弱TMZ處理介導的細胞毒效應,這表明線粒體至少是TMZ反應元件之一。但是ROS在腫瘤細胞中是一把雙刃劍,研究表明與生長、分化、存活等相關的多種氧化還原依賴性途徑的調節因子和路徑相關,如研究ROS 低劑量時激活存活通路,如NF-κB,PI3K/Akt等,高劑量時激活腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFr)、caspase凋亡通路,促進細胞凋亡[16]。雖然避免交叉抗性是治療腫瘤耐藥的重要策略,有研究表明,無論腫瘤耐藥的潛在機制如何,調節ROS水平是一種靶向和致敏 MDR 腫瘤細胞的有效方法,該方法對表達高水平 ABC 轉運體、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、表皮生長因子受體突變的耐藥腫瘤細胞具有敏感度和殺傷性[17,18]。這些提示提高細胞內多源ROS的表達,有可能成為增加TMZ對膠質瘤細胞療效的關鍵因素之一。大量文獻表明,ROS的產生和釋放是PDT的主要生物作用介質,后者可以對多種腫瘤起到抑制作用,如膠質瘤、胃癌、腎癌等[19,20]。

本研究發現,PDT聯合TMZ增加了細胞內總ROS的含量,根據現有文獻報道表明細胞內線粒體ROS 的上調,導致溶酶體的破壞,進而細胞內鈣離子超載,鈣離子超載可能會使線粒體凋亡向壞死轉變,同時ROS氧化應激在細胞內的累積可能也會觸發自噬、凋亡和壞死之間的相互轉化,具體死亡形式之間的轉化機制待后續更深入的研究加以闡述。上述理論可能是PDT增加TMZ對U251細胞增殖抑制,延緩TMZ應用過程中后續MDR發生的重要原因,本研究結果為解決膠質瘤的MDR提出了一種新的實驗策略。盡管有研究也發現耐藥膠質瘤細胞內ROS比敏感細胞水平高,但是膠質瘤細胞內具有高水平的抗ROS能力的各種酶類,如過氧化物歧化酶、過氧化氫酶等,這是耐藥膠質瘤細胞保持穩態因素之一,也是使TMZ的藥效發揮受阻礙,是膠質瘤獲得性耐藥的一個原因[21]。Brunetti等[22]研究也發現,異呋喃二烯與替莫唑胺協同誘導使細胞內 ROS 水平的增加,誘導細胞周期阻滯和細胞壞死增加神經膠質瘤細胞死亡。

研究表明,ROS可破壞線粒體膜,導致產生的ROS誘導線粒體氧化應激,從而啟動線粒體途徑的Bax/細胞色素C/caspase-3經典細胞凋亡途徑。線粒體膜兩側離子濃度差異所產生的跨膜電位差即MMP,是反映線粒體功能狀態的重要指標。Salmerón等[23]研究表明,MMP可以選擇性地光損傷一些參與凋亡的蛋白質,如caspase-3、caspase-8、p38-MAPK等。本研究中發現與單獨TMZ及對照組比較,PDT+TMZ能降低膠質瘤細胞內MMP的水平,說明聯合協同治療激活了膠質瘤細胞早期凋亡的發生,筆者推測是細胞內擴增的ROS 引發各種氧化應激反應,改變線粒體膜通透性,也包括激活內源性的半胱天冬酶,這增加了TMZ應用于膠質瘤過程中PDT輔助下抑制發生MDR的新證據。

綜上所述,本研究表明在PDT作用下,TMZ增加了膠質瘤細胞內ROS水平,提高了膠質瘤細胞對TMZ的敏感度,延緩了MDR的發生,為臨床克服TMZ化療過程中出現的MDR 提供了實驗基礎。然而黃天造等[24]研究表明,內質網氧化應激可以增加膠質瘤細胞保護性自噬來對TMZ產生抵抗,說明氧化應激在膠質瘤細胞內存在著復雜作用,后續有待繼續開展深入研究。