高甲基化相關的CCL5低表達促進肝癌細胞增殖及免疫抑制

楊小鳳,林若琳,王小鵬,朱麗,侯雋,王良海

(石河子大學醫學院/新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界性的重大公共衛生問題[1]。我國肝癌的發病率居世界首位,對全球肝病的負擔有著重大影響[2]。越來越多的證據表明肝癌微環境中免疫細胞失調,包括巨噬細胞浸潤增加和T細胞浸潤減少等[3-4]。肝細胞癌的發病機制和預后標志物仍有待于進一步研究[5]。

研究表明,腫瘤浸潤性CD8+T細胞與許多類型癌癥患者的良好預后相關[6]。趨化因子是8-14 KDa的小分子蛋白,存在于淋巴系統和各種組織中,在招募免疫細胞進入腫瘤組織的過程中發揮重要作用[7]。CCL5(C-C motif chemokine ligand 5),也被稱為RANTES,是大小為7.5 kDa的趨化因子[3]。CCL5已被發現在癌癥和炎癥性疾病中起重要作用[8-9]。Dangaj等[10]通過對人卵巢癌的研究發現,腫瘤細胞表達的CCL5和由巨噬細胞及樹突狀細胞表達的CXCL9對T細胞浸潤到腫瘤組織中至關重要 。Tang等發現CCL5可作為非小細胞肺癌的疾病預后指標和免疫檢查點治療靶點[11]。Zhang等[12]研究發現CCL5缺乏可增強結直腸癌中CD8+T細胞的瘤內浸潤。然而,目前CCL5在肝細胞癌中的表達水平和作用機制還沒有明確的定論[3,7,13]。

本研究通過分析GEO數據庫發現肝癌組織中CCL5表達較低并與患者預后不良相關。我們還對人肝癌組織標本中CCL5的表達進行了檢測,驗證了上述生物信息學結果。我們分析TCGA數據庫發現CCL5與肝癌的免疫微環境有關,高表達組浸潤更多的CD8+T細胞。此外,過表達CCL5能夠抑制肝癌細胞的增殖。本研究還發現腫瘤中CCL5的低表達是由啟動子DNA高甲基化引起的。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1 Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫

GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是存儲并免費分發微陣列、下一代測序(NGS)和其他形式高通量功能基因組數據的國際公共存儲庫[14]。本研究通過GEO數據庫分析了CCL5在肝癌組織中的表達高低及與患者的生存預后情況的關系。

1.1.2 The Cancer Genome Atlas Program(TCGA)數據庫

TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov)數據庫的研究人員對來自33種癌癥類型的11 160名患者的腫瘤分子結構進行了描述,并確定了它們的分子亞型[15]。本研究通過TCGA數據集分析了CCL5與免疫浸潤及甲基化的關系。

1.2 臨床樣本

收集石河子大學醫學院第一附屬醫院2011—2019年期間的肝癌石蠟組織標本,其中腫瘤組織103個,癌旁組織90個。這些患者在手術切除前均未接受放療或化療。所有患者均由至少兩位經驗豐富的病理醫師進行病理診斷。本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院人體研究倫理委員會批準。

1.3 免疫組織化學染色

將石蠟包埋組織切成4 μm厚的切片,經二甲苯脫蠟、酒精脫水后進行抗原修復。然后用3% H2O2抑制內源性過氧化物酶,磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌3次,每次5 min。洗滌后,將樣品與抗CCL5一抗混合(稀釋比1∶500;Abcam),在4 ℃的冰箱中孵育過夜。加二抗后將石蠟切片置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min。采用DAB試劑盒(ZSGB-Bio #ZLI-9018)對樣品進行顯色。將組織切片沖洗后用蘇木素快速染色,中性樹膠封片。根據著色強度(0分:未著色;1分:弱著色;2分:中等著色;3分:強著色)和著色細胞比例(0分:<5%;1分:5%～25%;2分:26%～75%;3分:75%～100%)對CCL5表達的免疫組織化學染色程度進行評分,每個樣本的最終免疫反應性評分為著色強度評分和著色細胞比例評分的乘積[16-17]。

1.4 細胞培養與主要試劑

人肝癌細胞株HuH-7購自中國科學院細胞庫,MHCC97 H購自碧云天生物技術有限公司,小鼠肝癌細胞由中國科學技術大學贈送。HuH-7、MHCC97 H和小鼠肝癌細胞常規培養在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養液中,置于5% CO2、37 ℃培養箱中孵育。主要試劑見表1。

表1 主要試劑及公司

1.5 細胞轉染

小鼠肝癌細胞接種于六孔板中,細胞密度達到70%～80%時用Lipofectamine 3000轉染過表達CCL5及其相應對照的質粒。轉染48 h后,用嘌呤霉素處理細胞14 d,進行單克隆篩選,構建穩定過表達的CCL5細胞系。

1.6 CCK-8增殖實驗

CCK-8法檢測轉染后的小鼠肝癌細胞的細胞增殖。將約2 500個細胞接種在96孔板中,細胞貼壁后,在不同時間點每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h。測定450 nm處吸光度,繪制細胞增殖曲線。

1.7 RNA提取和實時熒光定量PCR

使用 E.N.Z.A. Total RNA Kit I從細胞中分離出總RNA,NanoDrop 2000分光光度計測定提取的RNA濃度。將1 μg RNA逆轉錄成cDNA,然后進行實時熒光定量PCR擴增。本實驗采用β-actin作為內參,應用2-△△CT法分析實驗組和對照組的表達差異倍數。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。所有數據均以均數±標準差表示。兩組間比較采用Student’st檢驗,多組間比較采用單因素或雙因素方差分析估計。生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗。P<0.05被認為差異顯著。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1。

2 結果

2.1 CCL5在肝癌組織中顯著低表達

肝癌數據集GSE14520用來分析CCL5在肝癌中的表達分布。火山圖顯示CCL5為肝癌組織中差異表達基因的下調基因之一(P<0.05,圖1A)。在配對(P<0.001,圖1B)和非配對(P<0.001,圖1C)的肝癌樣本中,CCL5的表達都顯著降低。

A:對GSE14520數據集進行差異基因分析,火山圖顯示CCL5是肝癌中的一個下調基因;藍色:下調基因;紅色:上調基因;B-C:CCL5在配對的(B)和非配對的(C)肝癌樣本中均低表達。圖1 GEO數據庫分析CCL5在肝癌組織中的表達水平

為了進一步明確CCL5在肝癌中的表達情況,我們采用免疫組織化學染色檢測人肝癌組織及癌旁組織中CCL5的蛋白表達。CCL5信號主要定位在細胞質中(圖2A)。免疫組織化學染色評分的統計結果表明肝癌組織中CCL5的表達水平顯著下調(P<0.05,圖2B)。綜上所述,CCL5在肝癌組織中表達降低。

圖2 CCL5在臨床樣本中的表達水平分析

2.2 CCL5低表達與肝癌患者的不良預后有關

我們在GSE14520數據集中分析了CCL5表達與肝癌患者預后的相關性。結果顯示,當CCL5表達較低時,患者的總生存率(P<0.05,圖3A)和無復發生存率(P<0.05,圖3B)較差;CCL5表達高時,有利于患者的預后。

A-B:CCL5表達情況對肝癌患者的總生存期(A)或無復發生存期(B)的影響。圖3 GSE14520數據集中分析CCL5表達與肝癌患者預后的關聯

2.3 CCL5低表達與免疫抑制有關

Thorsson Vesteinn等人[18]的研究將免疫表型分為C1-C6型,依次由免疫浸潤型向免疫荒漠型轉變,不同亞型提示患者的免疫應答類型及不同預后結局。

我們分析TCGA數據庫中的肝癌免疫表型發現CCL5低表達組富集到更多的C4(淋巴細胞減少)亞型,該亞型與免疫抑制及預后差相關;而C2型(干擾素-γ為主)和C3型(炎性因子)在CCL5高表達組中富集(P<0.001),圖4A和4B,提示CCL5高表達有利于患者預后且表現為免疫浸潤性微環境。

A:CCL5在6種免疫亞型(C1-C6)肝癌組織中的表達水平分布;B:CCL5在C2-C4免疫亞型中的表達水平比較。圖4 CCL5低表達與免疫抑制表型相關

對TCGA數據庫中高表達CCL5組和低表達CCL5組的免疫評分進行比較發現(圖5A),低表達CCL5組的免疫評分較低(P<0.001),這意味著低表達CCL5組的免疫微環境較差。我們進一步在肝癌數據集GSE14520中分析CCL5表達水平與免疫細胞的浸潤情況,發現CD8+T細胞在CCL5高表達組浸潤較多(圖5B)。綜上所述,CCL5低表達與肝癌的免疫抑制微環境有關。

圖5 CCL5低表達的肝癌組織顯示較低的免疫評分

2.4 CCL5過表達能夠抑制肝癌細胞增殖

細胞過度增殖是癌變的重要特征之一[19]。我們通過實時熒光定量PCR驗證了CCL5過表達細胞系的成功構建(P<0.01,圖6A)。CCK-8增殖實驗結果顯示CCL5過表達組的細胞增殖速度低于CCL5對照組(P<0.001,圖6B),表明CCL5過表達能抑制肝癌細胞的增殖。

圖6 CCL5過表達能夠抑制肝癌細胞增殖

2.5 CCL5表達低與DNA高甲基化有關

我們通過MEXPRESS網站分析了CCL5在TCGA數據集肝癌組織中低表達的可能原因。結果表明,CCL5表達與拷貝數無顯著關聯,與啟動子DNA的甲基化呈顯著負相關(P<0.05,圖7A)。CCL5低表達組具有顯著升高的啟動子DNA甲基化水平(圖7B)。

A:Mexpress(https://www.mexpress.be/index.html/)顯示肝癌組織中CCL5表達與甲基化負相關。B:小提琴圖顯示了肝癌中CCL5表達與甲基化水平的關系。C:5’-Aza-2’-deoxycytidine和 DZNeP(均為1 μmol·L-1)處理肝癌細胞48小時后的CCL5的表達水平。圖7 CCL5表達水平與甲基化呈負相關

為了驗證CCL5與甲基化的關系,我們在體外對HuH-7和MHCC97H兩株肝癌細胞系進行了甲基化抑制劑處理。5’-aza-2’-deoxycytidine是DNA甲基轉移酶抑制劑,DZNeP是組蛋白甲基化抑制劑。結果發現抑制劑組的CCL5表達較未處理組顯著增加,提示CCL5在肝癌細胞中的低表達是由高甲基化引起的。

3 討論

肝細胞癌發生在慢性肝臟炎癥的環境中,與肝炎病毒慢性感染和酒精或黃曲霉毒素暴露等密切相關。深入地了解肝癌的病因和發病機制,有助于為肝癌患者的治療提供更多可能性[20]。

趨化因子的異常表達可以影響腫瘤組織中免疫細胞的遷移,形成腫瘤微環境,導致腫瘤進展[3,21]。CCL5是CC型趨化因子家族成員之一,與腫瘤和炎癥性疾病密切相關[22]。

本文就CCL5對肝癌免疫微環境及腫瘤細胞的影響為切入點,初步探討了CCL5在肝癌進展中的作用。我們首先通過生物信息學手段,在肝癌數據集GSE14520中發現CCL5的表達降低。為了驗證數據集結果的準確性,我們收集了103例肝細胞癌組織和90例鄰近組織作為對照,通過免疫組織化學染色證實了CCL5在腫瘤中低表達。預后分析發現CCL5低表達的患者總體生存期較差,更容易復發,提示CCL5低表達可能促進肝癌的發生發展。然而,CCL5在乳腺癌等腫瘤組織中的表達升高,沉默CCL5表達能夠抑制乳腺癌干細胞的增殖和侵襲能力[23-24],表明CCL5可能在不同腫瘤的發生發展中存在特異性的作用,值得廣大研究者進一步研究。

CCL5/CCR5信號通過NF-κB通路加速肝臟炎癥反應[25]。在風濕病患者滑膜積液和組織中檢測到CCL5表達水平的升高,伴隨著滑膜積液中CCR5+T細胞、單核細胞和NK細胞明顯增加和積累[9]。文獻還提示CCL5/CCR5與慢性炎癥性腸病有關[26]。本文分析CCL5表達與腫瘤組織中的6種免疫分子亞型(C1:傷口愈合;C2:干擾素-γ為主;C3:炎性因子;C4:淋巴細胞減少;C5:免疫靜止;C6: TGF-β為主)的相關性發現,CCL5低表達與C4淋巴細胞減少型密切相關,而CCL5高表達組表達更多的C2、C3炎性細胞浸潤亞型,說明CCL5在肝癌中與免疫抑制性微環境有關。不僅如此,我們還發現CCL5低表達組的免疫評分也較低,高表達組則CD8+T細胞浸潤較多。

本文進一步探索了肝癌中CCL5降低的原因。Mexpress網頁分析顯示,CCL5表達與甲基化水平呈負相關。肝癌細胞系用甲基化抑制劑處理后能夠使CCL5的表達升高,提示CCL5在肝癌中表達降低與高甲基化狀態有關。此外,腫瘤的發生發展總伴隨著腫瘤細胞的異常增殖。我們體外構建了CCL5過表達小鼠細胞系,結果發現過表達CCL5使細胞的增殖能力較對照組下降,說明CCL5過表達能夠抑制細胞增殖。

總的來說,本研究發現CCL5在肝細胞癌中表達下降并與患者預后不良相關。CCL5低表達誘導了肝癌免疫抑制性微環境及腫瘤細胞增殖。CCL5低表達是由細胞內的一種內源性因素(高甲基化)引起的。CCL5可作為肝癌的一種抑癌因子和預后指標。