枳實-白芍不同配伍比例及枳實生品與炮制品換用的枳實芍藥散化學成分研究

余遠盼，林桂梅，李醫名

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

枳實芍藥散由枳實和白芍兩藥配伍而成，始見于《金匱要略》“枳實（燒令黑，勿太過），芍藥等分。上二味，杵為散，服方寸匕，日三服，并主癰膿，以麥粥下之”，用于“產后腹痛，煩滿不得臥”。枳實性溫，能破氣消積、化痰除痞；芍藥酸寒，養血斂陰、緩急止痛。兩藥合用，枳實得芍藥行氣不傷血，芍藥得枳實養血不瘀滯，共奏行氣和血止痛之功[1-2]。枳實始載于《神農本草經》，歷代古籍記載有清炒、麩炒、土炒、面炒、炒炭、酒炙、醋炙、蜜炙、姜炙等多種炮制方法[3]。枳實藥性峻烈，麩炒后能緩和苦燥之性，增強健脾和胃之功[4]。枳實芍藥散中枳實為炒炭后入藥，可入血分行血中之氣滯。目前臨床使用枳實為生品或麩炒品，偶有使用清炒品[5]。《本草蒙筌》有“不及則功效難求，太過則氣味反失”，體現了不同炮制方法對藥物化學成分的影響不同。藥對作為臨床處方用藥中相對固定的配伍形式，在方劑配伍中起到相輔相成的作用，藥對配伍比例為經方研究的關鍵問題之一。有研究發現，藥對不同配伍比例對有效成分的溶出有很大影響[6-8]。研究藥對配伍比例對成分提取率的影響具有十分重要的意義。因此，不同炮制品枳實及枳實與白芍不同配伍比例對枳實芍藥散化學成分的影響值得探索。

本研究根據枳實芍藥散臨床實際使用情況，以其水煎液為研究對象，以辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥苷和芍藥內酯苷9個成分為指標，采用HPLC考察枳實-白芍藥對不同配伍比例及枳實生品與炮制品換用對枳實芍藥散化學成分提取率的影響，以期從化學成分變化角度為解析枳實炮制原理及經方配伍提供依據。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀（配置Waters e2695泵、Waters 2998檢測器，Empower 3數字處理軟件），沃特世公司；DFT-200型高速萬能粉碎機，浙江溫嶺市林大機械有限公司；PTHW型電熱套，上海棱標儀器有限公司；AS系列超聲波清洗機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；AE240型十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FA1004B型電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

枳實飲片和白芍飲片分別購于江西省和安徽省，經遼寧中醫藥大學王榮祥教授鑒定，分別為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果和毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》標準。麥麩（批號160801）購于安徽省。對照品辛弗林（批號110227-200306），中國藥品生物制品檢定所；蕓香柚皮苷（批號S0808 AS）、柚皮苷（批號A0319AS）、橙皮苷（批號D1106AS），大連美侖生物技術有限公司；新橙皮苷（批號200029）、芍藥內酯苷（批號102086），江蘇永健醫藥科技有限公司；芍藥苷（批號DSTDS007001）、沒食子酸（批號DST190715-008）、(+)-兒茶素（批號DST190628-001），樂美天醫藥/德爾特生物公司。所用對照品純度均不低于98%。甲醇、乙腈為色譜純（美國TEDIA公司），其他試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

2.1.1 清炒枳實

稱取大小分等的枳實飲片100 g。將炒鍋加熱至約180 ℃，投入凈枳實片，快速翻動，炒至枳實表面淡黃時，立即取出，攤開晾涼[9]。

2.1.2 麩炒枳實

取大小分等的枳實飲片100 g，麥麩10～15 g。將炒鍋加熱至約180 ℃，均勻撒入麥麩即刻煙起時，投入凈枳實片，快速翻動，炒至枳實表面淡黃色、麥麩焦黑色時，立即取出，篩除炒制后的麥麩，攤開晾涼[10]。

2.1.3 炒炭枳實

取大小分等枳實飲片100 g，炒鍋加熱至約220 ℃，投入凈枳實片，翻炒至枳實表面焦黑色、內部焦褐色，立即取出，攤開晾涼[9]。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 枳實生品和不同炮制品及白芍單煎液

分別精密稱取枳實生品和不同炮制品及白芍粉末（過4號篩）各約0.2 g，置于圓底燒瓶中，精密加入純凈水25 mL，加熱至沸騰后，保持微沸2 h，冷卻后過濾，精密量取續濾液5 mL于10 mL量瓶中，用純凈水定容至刻度后混勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 枳實生品和不同炮制品與白芍合煎液

分別精密稱取枳實生品和不同炮制品與白芍粉末（過4號篩）約0.2 g，按1∶1比例混合，置于圓底燒瓶中，精密加入純凈水25 mL，加熱至沸騰后，保持微沸2 h，冷卻后過濾，精密量取續濾液5 mL于10 mL量瓶中，用純凈水定容至刻度后混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內酯苷和芍藥苷對照品適量，加甲醇充分溶解并定容至刻度，制成濃度分別為0.307、1.313、1.036、0.508、0.486、0.484、0.503、0.486、0.515 mg/mL的對照品溶液。取各對照品溶液適量，制成混合對照品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 色譜條件

采用WondaSil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～18%A；10～25 min，18%～20%A；25～30 min，20%～25%A；30～35 min，25%～30%A），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，檢測波長230 nm，進樣量10 μL。對照品及枳實生品和不同炮制品的枳實芍藥散色譜圖見圖1。

圖1 枳實生品和不同炮制品的枳實芍藥散9個成分HPLC圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋成不同濃度的系列對照品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定。以對照品濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，9個成分線性關系考察結果見表1。各成分在相應濃度范圍內的線性關系良好。

表1 9個成分線性關系考察結果

2.5.2 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液，按“2.4”項下色譜條件連續進樣6次，記錄各成分峰面積并計算其RSD。結果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內酯苷和芍藥苷的峰面積RSD 分別為0.90%、0.60%、0.66%、0.64%、0.80%、0.86%、0.63%、0.70%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗

精密稱取枳實生品和白芍粉末適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件，于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，計算各成分峰面積RSD。結果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內酯苷和芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.20%、0.27%、0.13%、1.87%、1.52%、0.44%、1.37%、0.43%、0.77%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗

精密稱取6份枳實生品和白芍粉末適量，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件分別進樣測定，記錄各成分的峰面積并計算其RSD。結果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內酯苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.15%、1.03%、1.41%、1.85%、2.01%、0.61%、2.43%、0.60%、1.88%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗

精密稱取6份已知含量的生枳實和白芍混合粉末適量，分別精密加入適量各對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算平均回收率及其RSD。結果顯示，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素、芍藥內酯苷和芍藥苷的平均加樣回收率分別為97.96%、98.68%、99.24%、98.54%、98.46%、101.50%、97.24%、98.50%、99.27%，RSD分別為0.42%、0.83%、0.55%、1.11%、0.53%、0.51%、1.07%、0.52%、0.52%，表明該方法的準確度良好。

2.6 枳實-白芍不同配伍比例的枳實芍藥散樣品含量測定

分別精密稱取枳實生品和白芍粉末（過4 號篩）適量，按“2.2.2”項下方法分別制備不同配伍比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）枳實-白芍合煎液，并按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰面積，計算9個成分的含量，并計算提取率（該成分在總提取物中含量÷該成分所對應藥材的取樣量），結果見表2、圖2。

表2 不同配伍比例枳實-白芍合煎液9個成分提取率比較（mg/g，n=3）

圖2 不同配伍比例枳實-白芍合煎液9個成分提取率

由表2、圖2可以看出，在不同配伍比例的枳實-白芍合煎液中，蕓香柚皮苷、橙皮苷、沒食子酸、(+)-兒茶素和芍藥內酯苷的含量隨枳實所占比例增加而升高，推測枳實在該藥對中所占比例越大，越有助于上述5個成分溶出；當枳實-白芍配伍比例為2∶1、1∶1、1∶2時，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷在水煎液中的提取率最高。

2.7 枳實生品與炮制品換用的枳實芍藥散樣品含量測定

分別取枳實生品和不同炮制品及白芍粉末適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰面積，計算9個成分含量，結果枳實和白芍單煎液與枳實芍藥散中9個成分含量有一定差異，見表3。

表3 枳實生品和不同炮制品與白芍配伍前后9個成分含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

枳實的主要活性成分包括生物堿和黃酮兩大類，其中以柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷為代表的黃酮類成分具有抑制平滑肌收縮、改善功能性消化不良大鼠胃排空及抗炎、抗氧化等作用[11-13]，是枳實破氣消積的主要活性物質，生物堿類代表成分辛弗林為《中華人民共和國藥典》枳實的指標成分，因此，選取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及辛弗林含量為枳實的考察指標。白芍中以芍藥苷為代表的單萜及其苷類具有保肝、鎮痛、抗抑郁、抗腫瘤等作用[14-16]，而鞣質類成分也發揮著重要的藥理作用，因此，選取芍藥苷、芍藥內酯苷、沒食子酸和(+)-兒茶素含量為白芍的考察指標。

本試驗對供試品溶液進行全波長掃描，發現辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及沒食子酸在波長230 nm和283 nm處出峰均較好，芍藥苷、芍藥內酯苷、(+)-兒茶素在波長230 nm處出峰較好，因此檢測波長確定為230 nm。同時比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2%乙酸水、甲醇-磷酸二氫鉀溶液等流動相，發現甲醇-水溶液分離效率較低，而乙腈-水系統具有較好的色譜分離效果。為有效改善部分色譜峰的拖尾現象，加入磷酸以提高分離度。最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液。

枳實與白藥配伍見于大柴胡湯、麻子仁丸、四逆散、排膿散等經典方劑，現行藥品質量標準中以枳實-白芍配伍入藥的中成藥也較多，如2020年版《中華人民共和國藥典》收載的脾胃舒丸（枳實∶白芍=1∶1）、香連化滯丸（枳實∶白芍=1∶2）、麻仁丸（枳實∶白芍=1∶1）、麻仁滋脾丸（枳實∶白芍=4∶3）等[17]。中藥化學成分復雜，配伍應用時常發生助溶、沉淀等物理現象[18]，配伍后有些成分的結構、溶出率等也會發生變化，可能影響藥物臨床治療效果。本研究建立了HPLC同時測定枳實芍藥散9個成分含量的方法，發現其在單煎液和枳實-白芍不同配伍比例合煎液中的提取率有一定差異，表明枳實與白芍配伍后其化學成分含量發生變化。當配伍比例為2∶1、1∶1和1∶2時，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷3個主要藥效成分在水煎液中的提取率高于其他配伍比例，表明合理的配伍比例有助于成分溶出，體現了經方配伍在方藥運用中的重要性。枳實-白芍不同配伍比例對肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的藥效學實驗發現，當枳實-白芍比例為1∶1和2∶1時，其抗抑郁、鎮痛、調節胃腸道功能作用較好，體現了古方配伍（1∶1）用藥的合理性[19-21]。

本研究發現，白芍與枳實配伍后化學成分發生變化：組方與單味藥白芍相比，芍藥內酯苷、沒食子酸、(+)-兒茶素的含量增加；生品及不同炮制品之間比較，清炒枳實芍藥散中芍藥苷和(+)-兒茶素的含量高于其他樣品，而芍藥內酯苷和沒食子酸的含量在炒炭枳實芍藥散中最高。

對比枳實生品和不同炮制品與白芍配伍前后黃酮苷類成分含量發現，單味藥和復方中枳實經清炒和麩炒后柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量增加，而炒炭后黃酮苷類成分均降低。黃酮苷類成分作為枳實增強胃腸功能的主要活性物質，麩炒可提高黃酮苷類成分含量，保證其健脾消積作用，推測可能是麥麩在炒制過程中通過吸附等形式，將輔料中的成分傳遞至炮制品，還能吸收飲片中的部分揮發性成分，達到增強療效、緩和燥性的作用；清炒也有助于黃酮類成分的溶出，可能是炒制過程破壞了細胞壁結構，促進了成分的溶出，但長時間加熱可能會破壞其結構，故炒制過程中應該控制好溫度和時間。枳實與白芍配伍后枳實中黃酮苷類成分含量降低而白芍中芍藥內酯苷、沒食子酸、(+)-兒茶素含量增加，表明與白芍配伍對白芍有效成分的溶出有促進作用，有利于增強白芍緩急止痛作用，結合枳實、白芍的性味特點發現，兩者藥性大致相反，配伍后能夠相反相成。同時，枳實主要活性物質辛弗林經清炒和麩炒后含量有所增加，但炒炭后含量大幅降低，推測為長時間高溫加熱破壞其結構所致。另外，沒食子酸含量在炒炭枳實芍藥散中最高，可能是炒制過程中某些成分發生了分解或某些物質的轉化使其含量增加，這與古籍中用于治療婦女產后氣滯、氣結血凝等煩滿不得臥相符，也證實了枳實芍藥散中枳實炒炭的合理性。

本研究從炮制與經方配伍角度，比較枳實生品與炮制品換用的枳實芍藥散化學成分變化，詮釋古籍中運用炮制品的合理性。今后將從入血成分及其代謝情況入手開展研究，以期從體內物質代謝角度揭示枳實炮制原理。