蝴蝶蘭外植體(花梗)消毒效果試驗研究

劉鈺 周勝芳 夏豫川 任羽

摘? ?要? ?以開花后的蝴蝶蘭花梗為外植體，對影響外植體誘導的消毒方式、二次消毒、外源激素等進行探究，對蝴蝶蘭外植體實驗過程中產生的污染進行原因分析。試驗結果表明： ① 0.1%的HgCl2消毒16分鐘時效果最好;0.15% HgCl2的消毒效果要優于0.1%的，且在消毒10分鐘時效果最好。② 對污染的花梗進行二次消毒，按初次消毒的方式消毒后，再用多菌靈浸泡15分鐘后放入添加抗生素的培養基效果最好。

關鍵字? ?蝴蝶蘭;誘導;組織培養;污染

蝴蝶蘭，是蘭科蝴蝶蘭屬的常綠草本植物。因蝴蝶蘭的色彩鮮艷、造型別致、花期較長而享有“洋蘭皇后”的美譽，深得消費者的喜愛。蝴蝶蘭的葉大、莖短、花一到數枚，由于花形似蝶得名，與卡特蘭、石斛蘭、萬代蘭并稱為四大觀賞蘭。目前已經發現超過70個蝴蝶蘭的原生種，其原產于熱帶、亞熱帶雨林地區， 我國臺灣和東南亞等地區均有分布。現有的蝴蝶蘭雜交品種很多，經過官方認證的蝴蝶蘭品種已經達到了10萬多個，現已在全世界廣泛栽植。蝴蝶蘭不是寄生性植物，而是附生蘭，僅立足于附生物上，在空氣中吸收水分，在樹皮裂隙的腐殖質中汲取有機物。

蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，其種子小且無胚乳，只有一層非常薄的種皮，在自然條件下很難萌發。因此組織培養是蝴蝶蘭快速繁殖的重要途經，植物組織培養技術可以保持植株優良性狀，保存種質資源，還能夠將蝴蝶蘭繁殖周期縮短，從而獲得大量的植株。

現在生產和工業上使用的蝴蝶蘭植物組織培養技術主要有：①原球莖途徑。原球莖途徑主要是指采用蝴蝶蘭的離體器官如葉、莖等來誘導產生原球莖，進一步誘導原球莖獲得分生苗;②利用種子無菌播種得到實生苗;③直接誘導出叢生芽。一直以來，原球莖途徑是人們研究的重點，但主要有兩方面不足，一是繁殖系數低或容易使母株喪失，二是遺傳不穩定，后代容易發生變異。利用叢生芽途徑快速繁殖就能很好的解決變異的問題。

根據外植體不同的帶菌程度采取有效的消毒措施是組織培養的關鍵。酒精和升汞是植物組織培養中常用的消毒試劑，能夠使蛋白質脫水變性從而達到消毒效果。宋火元研究表明，0.1%升汞對蝴蝶蘭外植體有明顯的消毒效果，但是處理時間過長后升汞殘留較多，其毒性影響了外植體的生長，在消毒時間超過22分鐘時外植體甚至完全失活。因此研究外植體消毒時間對外植體脫毒效果的影響，對蝴蝶蘭擴繁產業有重要的? ? 意義。

1 材料與方法

1.1 材料? ?蝴蝶蘭花梗取自西華師范大學生命科學學院培養室。

1.2? ?方法

1）外植體的消毒。選擇生長健壯的蝴蝶蘭植株，取已開花的花梗作為誘導的外植體材料，不破壞腋芽。枝剪消毒后將外植體剪成2～3 cm的小段，每段含一個腋芽，先用洗潔精溶液沖洗去表面的灰塵雜質，放入肥皂水浸泡20～30分鐘后，再用自來水沖洗20～30分鐘，然后進行無菌消毒處理。

在超凈工作臺上先用75%的酒精消毒30秒后用HgCl2（升汞）消毒（濃度及時間見表1），然后用無菌水沖洗莖段上殘留的HgCl2，再用無菌濾紙吸干水分后放置在無菌盤中，將花梗切成 1～1.5 cm 的莖段（保留腋芽，并將花梗腋芽外的包葉剝去），芽的下端斜切，上端平切，順勢插于培養基中，不要淹沒芽點。培養室溫度設置為（25±1） ℃，光/暗周期14小時/10小時。

2）二次消毒。將污染的外植體按照初次消毒的方式同樣消毒后，放入多菌靈中浸泡（0分鐘、15分鐘、30分鐘）后放入培養基（含抗生素、不含抗生素）。采用正交試驗方法設計正交表（表2），接種20天后統計出芽率。

2 結果分析

2.1? ?消毒方式對外植體誘導的影響? ?在蝴蝶蘭生長過程中，植株體內會攜帶一定的內生菌，要達到徹底消毒的效果，關鍵是選擇有效的消毒方式。從表4中可以看出，當HgCl2的濃度為0.1%時，消毒的時間越長，消毒的效果越好，其污染率越低，0.1%HgCl2消毒16分鐘效果最好，但是存活率為零。可能是因HgCl2毒性大損傷腋芽影響植株正常生長。HgCl2濃度為0.1%時，最佳消毒時間為14分鐘。但此組消毒效果不理想，或許是由于外植體自身攜帶的病菌較多或操作過程出現失誤所致。0.15%的消毒效果優于0.1%，0.15%氯化汞消毒10分鐘，污染率20%，存活率80%，效果最好，但隨著消毒時間的增加污染率呈現先降低后增加的趨勢。

2.2? ?二次消毒效果對比? ?經過和二次消毒后結果見表4。可以看出，在相同的多菌靈浸泡時間下，培養基中添加抗生素二次消毒效果更好;在相同的培養基中，使用多菌靈浸泡，二次消毒效果更好，多菌靈浸泡15分鐘污染率雖達50%、但存活率較浸泡30分鐘高出25%。綜合考慮使用多菌靈浸泡15分鐘后植入添加抗生素的培養基效果較好。

3? ?污染原因分析

污染是蝴蝶蘭組培過程中無法回避的。培養基滋生各種霉菌，影響組培材料生長、發育。在工廠化育苗過程中，若是污染率持續走高，導致蝴蝶蘭組織培養的成本升高，將影響整個工廠化育苗的成功與否。

3.1? ?外植體? ?外植體是植物組織培養或其他體外實驗的植物器官和組織的切段。蝴蝶蘭外植體長期暴露在空氣中，與外界的環境直接接觸，對外植體滅菌不徹底，是導致污染的一個十分重要因素。外植體內攜帶的病原菌產生的污染是全身性的，占一定比例。具體表現為：通常培養數周后，外植體攜帶的病菌從培養基接觸外植體的地方擴散開來，甚至直接從外植體中長出。

3.2? ?環境? ?在操作過程中，接種臺周圍，或者環境中含有霉菌和成熟孢子，組培苗污染率將會大大提高。

3.3? ?操作不規范? ?接種過程中使用的各種器械，如鑷子、接種盤等工具滅菌不完全會導致污染，不規范操作也會造成污染。整個接種過程步驟和操作繁雜，接種人員不經意會造成工具污染。

3.4? ?后期管理? ?接種工作完成后，組培瓶放在培養室培養，不僅要嚴格把控培養室的溫度和光照情況，衛生狀況也要嚴格要求。培養室保持干燥，防止霉菌滋生，及時觀察和清除污染的瓶苗。

4? ?褐化

在整個組織培養過程中，蝴蝶蘭材料常常出現褐化現象。產生褐化主要是因為植物組織多酚氧化酶和酚類物質相結合，在氧氣的作用下發生化學反應形成醌類物質。醌類物質呈褐色，當其進入培養基不僅影響植物體內酶的活性，使得植物無法正常代謝，還甚至會使植物死亡。

為防止褐化常常使用抗氧化劑和吸附劑。抗氧化劑主要有維生素等，吸附劑有活性炭等。谷胱甘肽和檸檬酸一般控制褐變，但對植物生根和芽形成影響不大。及時切除變黑區域，及時更換培養基也可以有效防止變褐化。

5? ?結論與討論

莖尖、葉片、根尖、頂芽等都可以用作外植體進行組織培養，不同部位方法和難易程度不同，如選用腋芽為外植體，蝴蝶蘭植株損傷小且取材方便。研究外植體升汞消毒時間對外植體脫毒效果的影響，為蝴蝶蘭擴繁產業提供理論依據。當前常見的花梗消毒處理方式是采用0.1%升汞浸泡，具有方法簡單，消毒效率高的優點，但是安全性低。付鎮芳等將NaClO（次氯酸鈉）溶液和升汞的消毒效果進行比較，發現NaClO溶液的消毒殺菌作用遠不如升汞好。

本實驗考慮到取開花后的花梗作為外植體，故使用0.1%、0.15% 的HgCl2對外植體進行消毒。研究表明在HgCl2的濃度為0.1%時，消毒的時間越長，消毒的效果越好，但是隨著消毒時間的增加存活率降低。當HgCl2的濃度為0.15%時，結果顯示0.15%HgCl2消毒效果要優于0.1%。當0.15%HgCl2的氯化汞消毒10分鐘時，消毒效果最好，隨著消毒時間的增加污染率呈現先降低后增加的趨勢。

蝴蝶蘭花梗外植體寶貴，污染后直接扔掉很浪費，因此將污染的外植體進行二次消毒對工廠化育苗和實驗室培養都有著重要的意義。對初次消毒后污染的蝴蝶蘭花梗外植體進行二次消毒，研究表明多菌靈和抗生素對二次消毒的效果較好，但多菌靈浸泡時間過長，毒性大損傷芽，影響植株正常生長。

參考文獻

[1] 盧思聰. 中國蘭與洋蘭[M]. 北京：金盾出版社， 1994.

[2] 黃勝琴， 郭建軍， 葉慶生， 等. 溫度對蝴蝶蘭成花誘導的研究初探[J]. 中山大學學報（自然科學版）， 2003（04）： 132-134.

[3] 曹孜義，劉國民. 實用植物組織培養技術教程[M].甘肅：甘肅科學技術出版社， 1996.

[4] 陳宇勒. 洋蘭欣賞與栽培圖說[M].北京：金盾出版社 ， 2004.

[5] Park S Y ，Murthy H N ，Paek K Y . Rapid?propagation ofPhalaenopsisfrom floral stalk-derived leaves[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant， 2002， 38（2）：168-172.

[6] Ya Huei CHEN，Yi Jung TSAI，Fure Chyi? CHEN.Transcription analysis of peloric mutants of Phalaenopsis orchids derived from tissue culture[J].Cell Research，2005（08）：639-657.

[7] 潘學峰， 王安石， 李海珠. 蝴蝶蘭組培快繁技術的研究進展[J]. 熱帶林業， 2005（01）： 45-47.

[8] 楊松宸，趙德剛，趙懿琛.六盤水小黃姜脫毒快繁技術及遺傳變異研究[J].分子植物育種，2017，15（12）：5 070-5 078.

[9] 胡凱，張立軍，白雪梅，等.植物組織培養污染原因分析及外植體的消毒[J].安徽農業科學，2007（03）：680-681.

[10] 宋火元.不同消毒處理及保存時間對蝴蝶蘭外植體脫毒效果的影響[J].現代園藝，2019，42（17）：31-33.

[11] 陳桂敏，鄭羽書，楊佩華，等.不同外植體對蝴蝶蘭組培快繁的影響[J].中國園藝文摘，2013（11）：15-16.

[12] 張彩玲.蝴蝶蘭花梗組織培養與快速繁殖的研究[J].中國林副特產，2010（5）：42-44.

[13] Chen Y C ，Chen C ，Chang W C . A reliable protocol for plant regeneration from callus culture of Phalaenopsis[J]. vitro cellular & developmental biology plant， 2000， 36（5）：420-423.

[14] 付鎮芳，何博，馬杰，等.蝴蝶蘭“大辣椒”花梗組織快繁技術研究[J].林業科技通訊，2017（05）：66-69.

[15] 周利利. 蝴蝶蘭組培快繁體系的建立[D].杭州：浙江農林大學，2017.

[16] 高壯壯，婁倩，劉雅莉.蝴蝶蘭‘大辣椒組培快繁技術體系的優化[J].西北林學院學報，2020，35（04）：95-100+211.