白及炭疽病病原菌的鑒定及其室內防治藥劑篩選

侯秀明， 王晗怡， 陳婷婷， 高萌，高乞， 廖宏澤， 周浩，2

1. 廣西民族大學 海洋與生物技術學院/廣西多糖材料與改性重點實驗室，南寧 530006；2. 廣西民族大學 海洋生物資源保護與利用重點實驗室，南寧 530006

白及[Bletillastriata(Thunb.) Rchb. f.], 又名白給、 地螺絲, 是蘭科白及屬多年生草本植物, 也是我國傳統的藥用植物． 白及具有收斂止血、 消腫生肌和美容的功效, 首次記載于漢代的《神農本草經》, 已被《中國藥典》收錄[1]． 白及提取液可用于血管栓塞劑、 代血漿等醫用材料, 白及多糖膠可作為食品保鮮劑[2]． 白及因藥用功能的挖掘而不斷擴大其應用范圍和市場需求, 其價格也從10元/kg增至800～1 000元/kg[3]． 近年來, 隨著白及組培技術的建立和成熟[4], 人工種植業開始興起, 多集中在我國西南、 華中以及長江流域等地區, 然而伴隨的白及病害也逐漸增加, 嚴重時造成白及大幅度減產, 影響了白及產業的發展．

目前對白及的研究多集中于藥用價值及種植方面, 對白及病害的研究較少． 已報道的真菌病害有:Fusariumoxysporum可引起白及根腐病[5],F.fujikuroi可引起白及黑斑病[6],Epicoccumsorghinum可引起白及葉斑病[7]． 炭疽病是由刺盤孢屬(Colletotrichumspp.)真菌引起的植物病害的總稱, 危害植物葉片、 莖和果實． 本研究在對廣西桂林市白及種植基地病害調查中發現葉片上有疑似炭疽病, 且病害嚴重． 通過采集白及發病葉片組織, 利用組織分離法與單孢純化法分離病原, 結合顯微形態與多基因系統發育分析鑒定該病害病原, 明確桂林市白及種植基地炭疽病病原菌的分類地位, 并通過室內毒力測定進一步篩選出防治白及炭疽病的有效殺菌劑, 以期為白及炭疽病病原真菌的科學診斷與病害防治提供理論基礎．

1 材料

1.1 供試植物材料

供試病害植株與健康植株均從廣西桂林市白及種植基地采集． 炭疽病病癥植株放入無菌袋中保存并編號, 帶入實驗室分離． 采集健康白及塊莖放入溫室培養．

1.2 供試材料及培養基

材料有Taq DNA聚合酶, 10× EasyTaq Buffer, dNTP, 氯仿, 異丙醇, 1% CTAB． 供試殺菌劑共8種, 分別為多菌靈(Carbendazim, 50%可濕性粉劑, 四川國光農化股份有限公司); 代森錳鋅(Mancozeb, 70%可濕性粉劑, 四川國光農化股份有限公司); 代森鋅(Zineb, 70%可濕性粉劑, 四川國光農化股份有限公司); 苯菌靈(Benomyl, l0%可濕性粉劑, 藍豐生物化工有限公司); 丙森鋅(Propineb, 70%可濕性粉劑, 德國拜耳作物科學公司); 苯醚甲環唑(Difenoconazole, 10%水分散粒劑, 瑞德豐生物科技); 肟菌戊唑醇(Nativo, 75%水分散粒劑, 德國拜耳作物科學公司); 敵磺鈉(Fenaminosulf, 70%可濕性粉劑, 山東天威農藥有限公司)．

所用培養基共3種, 分別為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA): 馬鈴薯200 g, 葡萄糖20 g, 瓊脂20 g, 水1 L; 燕麥培養基(OA): 燕麥片30 g, 瓊脂20 g, 水1 L; 麥芽汁培養基(MEA): 麥芽浸提物34 g, 瓊脂20 g, 水1 L．

1.3 主要設備儀器

萊卡生物顯微鏡(DM2000 LED), 德國徠卡; 超凈工作臺(S.SW-CJ-2F型), 恒宇公司; 電熱恒溫培養箱(HPS-250型), 哈爾濱市東明醫療儀器廠; 臺式微量離心機(D3024型), 大龍興創實驗儀器(北京)股份有限公司; 全自動立式高壓滅菌器(GI54DP型), 廈門致微儀器有限公司; PCR儀(PDC0200型), BOD-RAD; 電泳儀(JY600PJ型), 北京君意東方電泳設備有限公司; 相機(2013DJ6792型), 佳能有限公司．

2 方法

2.1 田間病害觀察與樣品采集

2019年5月至7月, 在廣西桂林市白及種植基地發現疑似炭疽病病癥的白及葉片, 拍照記錄田間發病樣苗病灶, 采集發病樣苗帶回實驗室．

2.2 病原菌的分離、 純化及保存

對患病葉片觀察、 拍照并標號, 采取組織分離法[8]分離病原菌． 將葉片洗凈后取多個病健交界處葉塊(5 mm×5 mm), 表面消毒晾干后置于PDA平板上, 于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養． 待組織長出菌落后, 在新鮮的PDA平板上收集分生孢子, 制備懸浮液(106個/mL), 利用平板稀釋畫線法純化病原菌[9], 純培養物用PDA斜面保存于4 ℃冰箱中．

2.3 致病性測定

將純培養物接種到含氯霉素(25 μg/mL)的PDA上, 25 ℃黑暗培養5 d, 用打孔器獲取直徑5 mm菌餅待用, 將健康白及葉片消毒, 用牙簽在葉片上間隔5 cm制造傷口, 在傷口處接種菌餅, 刺傷的白及葉片作為空白對照, 定期觀察葉片發病情況并記錄, 重復3次．

2.4 形態學觀察

2.5 分子生物學鑒定

接種培養物于PDA中, 待菌絲長滿后, 使用CTAB法[11]提取DNA． 用引物(表1)分別擴增ITS,ACT,TUB2,CHS-1,GAPDH,HIS3, 引物均由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成． 擴增體系(25 μL): 無菌去離子水20.9 μL, 10×EasyTaq Buffer 2.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, EasyTaq 0.1 μL, DNA模板1 μL． 擴增程序: 94 ℃預變性3 min, 94 ℃變性45 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 循環35次, 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保溫． 擴增完成后, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 將符合預期大小的PCR產物送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序, 使用Vector NTI軟件[12]對測序結果進行檢查校準, 將序列上傳NCBI數據庫獲得序列登錄號． 依據Damm等[13]以及Marin-Felix等[14]的報告獲得參考序列登錄號(表2), 利用TBtools[15]下載參考序列, 通過PhyloSuite1.22軟件[16]進行序列比對和拼接, 并采用ML(最大似然法)構建系統發育樹, 設置自檢值為20 000, 選擇C.pseudoactatum作為外類群．

表1 白及病原真菌PCR擴增所用引物

表2 本研究中系統發育分析所用炭疽病屬菌株相關信息和GeneBank登錄號

2.6 不同殺菌劑對病原室內毒力測定

采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對白及炭疽病菌的室內毒力, 供試殺菌劑濃度依次設置為0.01,0.1,1,6.25,10,12.5,25,50,100 μg/mL[24], 以無菌水作為空白對照, 每處理重復2次, 96 h后采用十字交叉法測得不同處理的菌落直徑, 通過Excel 2010計算不同濃度殺菌劑對病原菌生長的抑制率． 選取濃度為0.01,0.1,1,10,100 μg/mL處理組展示藥劑抑制效果．

I=[(dc-dt)/dc]×100

式中,I為抑制率(%),dc為空白對照菌落純生長量,dt為實驗組菌落純生長量, 菌落純生長量通過實驗組菌落平均直徑減去接種菌餅直徑測得．

采用GraphPad Prism 8.0以殺菌劑濃度為橫坐標, 抑制率為縱坐標制作殺菌劑抑制作用曲線圖, 并計算半數有效濃度(EC50), 判斷不同殺菌劑的藥效．

3 結果與分析

3.1 白及炭疽病田間癥狀

病害初期表現為葉片上出現深褐色的不規則狀斑點, 單個葉片出現多個病斑, 病健交界處明顯, 后期病斑擴大, 融合形成不規則的深褐色大病斑, 繼而整個葉片枯萎(圖1)． 該病害為白及種植基地多發病害, 造成白及葉片脫落, 植株死亡．

圖1 白及炭疽病發病癥狀

3.2 病原菌致病性測定

接種分離病原菌典型菌株BJ103.2, 葉片3 d后出現黃褐色病斑, 6 d后病斑擴大為橢圓形, 接種部位有菌絲出現, 9 d后, 病斑蔓延到整個葉片, 葉片枯萎; 對照組(CK)不發病(圖2), 該癥狀與田間癥狀相似． 再次從該發病葉片病健交界處分離病原菌, 與所接種病原菌一致． 依據柯赫氏法則, 分離菌株BJ103.2為白及炭疽病的致病菌．

圖2 菌株接種葉片發病癥狀

3.3 病原菌形態學特征

在PDA平板上, 恒溫培養箱內25 ℃黑暗培養病原菌, 2 d后菌絲直徑為1.2 cm, 7 d后長成完整的圓形菌落, 平均生長速度為0.43 cm/d． 表面為淡綠色毯狀的氣生菌絲, 整體凸起． 菌落背面中心為墨綠色, 外圈為綠色． 接種于MEA平板, 培養條件一致, 菌落呈圓形, 表面扁平, 毯狀菌絲, 菌落背面中心為黃褐色, 外圈為淡黃色． 接種于OA平板, 培養條件一致, 菌落呈圓形, 表面扁平, 束狀菌絲, 菌落背面中心為灰褐色, 外圈為白色(圖3a-3c)． 顯微鏡下, 無分生孢子堆和剛毛, 分生孢子簇生于孢子梗, 分生孢子呈棒狀形, 兩端微鈍或一端稍尖, 單胞, 接近無色, 大小為(8.6～19.4)μm×(1.6～4.2)μm(圖3d)． 孢子梗無色, 有隔; 分生孢子萌發可以從一端或兩端同時長出牙管, 并在一端形成分生孢子附著孢, 呈橢圓形或燈泡形, 邊緣平滑, 淺灰色, 大小為(3.4～9.5)μm×(2.9～6.6)μm(圖3e)． 依據Damm等[13]形態學特征的報告, 初步判斷該病原菌為炭疽病屬真菌．

圖3 BJ103.2形態學特征

3.4 系統發育學分析

以代表菌株BJ103.2的基因組DNA為模板進行PCR擴增, 測序后將序列上傳NCBI數據庫, 獲得序列登錄號, ITS(MZ268251),GAPDH(MZ889101),CHS-1(MZ267729),HIS3(MZ267730),ACT(MZ267728)以及TUB2(MZ267731)． ITS,ACT,CHS-1,HIS3,GAPDH,TUB2序列BLAST結果顯示, 菌株BJ103.2與CBS 631.80相應序列一致度高于97%． 以ITS進行比對, BJ103.2與C.orchidophilum(登錄號: JQ948152)序列一致度為99.26%(533/537, 存在2個Gap); 以ACT進行比對, 與C.orchidophilum(登錄號: JQ949473)序列一致度為98.78%(243/246, 無Gap); 以CHS-1進行比對, 與C.orchidophilum(登錄號: JQ948813)序列一致度為98.23%(277/282, 無Gap); 以HIS3進行比對, 與C.orchidophilum(登錄號: JQ949143)序列一致度為97.64%(373/382, 無Gap); 以GAPDH進行比對, 與C.orchidophilum(登錄號: JQ948482)序列一致度為97.06%(198/204, 存在2個Gap); 以TUB2進行比對, 與C.orchidophilum(登錄號: JQ949803)序列一致度為99.18%(486/490, 存在1個Gap)． 構建系統發育樹, 結果顯示, BJ103.2與炭疽病屬C.orchidophilum聚為同一支, 其自舉值大于90(圖4)． 結合形態特征, 鑒定該病原菌為C.orchidophilum．

圖4 菌株BJ103.2及其相似菌株的系統進化樹

3.5 不同殺菌劑對病原室內毒力測定

不同殺菌劑對白及炭疽病室內毒力測定結果見圖5和圖6．

圖5 不同殺菌劑對白及炭疽病病原菌BJ103.2的抑制效果

圖6 不同殺菌劑對白及炭疽病的抑制效果曲線圖

結果表明, 8種藥劑對病原菌生長均有抑制作用, 但不同殺菌劑對病原菌生長的抑制作用不同． 肟菌戊唑醇、 多菌靈、 苯菌靈、 代森錳鋅、 苯醚甲環唑的抑制作用明顯, 在濃度分別為8.5,5.8,32.8,48.8,55.2 μg/mL時, 抑制率大于60%, 但多菌靈并不能完全抑制病原菌的生長． 此外, 在濃度分別為71.7 μg/mL和98.2 μg/mL時, 肟菌戊唑醇與代森錳鋅抑制率達到100%, 但白及炭疽病對肟菌戊唑醇比較敏感, 其EC50為7.92 μg/mL, 代森錳鋅EC50為1 680 μg/mL, 表明病原菌對其不敏感． 敵磺鈉與代森鋅抑制效果較差, 在炭疽病防治中不具有指導意義． 綜上所述, 肟菌戊唑醇可作為防治白及炭疽病的有效殺菌劑．

4 討論

炭疽病菌的寄主廣泛, 傳播途徑多, 其孢子在土壤中越冬, 通過雨水或人工澆水在農田中廣泛傳播, 也可通過病蟲與栽培人員進行傳播． 其侵染能力強, 危害程度大, 對我國農業發展有嚴重的影響, 如C.fioriniae能導致四川肉桂炭疽病[25],C.fructicola能引起櫻桃炭疽病[26],C.acutatum能引起西班牙扁桃炭疽病[27]．C.orchidophilum主要在蘭科植物上引起炭疽病, 1902年正式命名, 2011年在我國南方的多種蘭科植物上發現該種病原菌[28]． 本研究通過致病實驗, 結合形態學和分子生物學證據, 明確該種白及炭疽病病原菌為C.orchidophilum, 在廣西省內首次報道． 該病原在自然狀態下致病力極強, 有待于進一步開展致病機理和科學防控研究．

在本研究中, 通過生長抑制實驗, 發現肟菌戊唑醇能有效抑制C.orchidophilum在PDA上的生長． 肟菌戊唑醇水分散粒劑是肟菌酯和戊唑醇混合而成的殺菌劑, 其中肟菌酯是一種呼吸抑制劑, 通過抑制呼吸作用達到抑菌效果, 而戊唑醇可抑制病原真菌體內甾醇脫甲基化, 阻礙菌絲生長． 肟菌戊唑醇對水稻稻曲病、 香蕉黑星病、 黃瓜白粉病、 炭疽病、 白菜炭疽病和番茄早疫病有良好的防治效果[29]． 研究表明, 在PDA上, 8種不同殺菌劑對典型菌株BJ103.2菌絲生長的抑制作用不同, 其中肟菌戊唑醇對C.orchidophilum的抑制作用最強,EC50為7.92 μg/mL, 暗示在種植基地噴灑肟菌戊唑醇防治該種白及炭疽病可取得較好的效果． 本研究中的藥敏實驗是在室內進行的, 由于田間環境與實驗室環境存在一定差異, 所以在實際應用之前, 有必要開展后續田間藥效實驗．