家蠶小分子熱激蛋白BmHsp19.1基因克隆及在蠶卵中的表達特征

龔競， 張偉， 唐苗， 程悅靜， 龐家欣

1. 西南大學 蠶桑紡織與生物質科學學院，重慶 400715；2. 資源昆蟲高效養殖與利用全國重點實驗室，重慶 400715

昆蟲種類眾多、 分布廣泛, 受益于昆蟲在進化過程中生成的多種適應環境條件的能力, 滯育便是昆蟲周期性度過不良生存環境的一種策略． 與休眠不同, 滯育是昆蟲經年累月受到特定的刺激(例如光周期、 溫度等)[1], 將這些外部信號轉化為生物的一種特性, 并遺傳給后代． 進入滯育的昆蟲, 新陳代謝速率下降、 應激耐受力增強、 生長發育停滯[2]．

滯育可以發生在昆蟲生長的任一階段, 按照不同的發育時期, 可分為卵滯育、 幼蟲滯育、 蛹滯育和成蟲滯育[3]． 家蠶(Bombyxmori)是典型的卵滯育昆蟲, 遺傳背景清晰, 有重要的經濟價值． 實際生產中, 常使用一些特殊的處理法(如即時浸酸法、 冷藏浸酸法)阻斷或解除滯育[4], 使其進入正常的發育狀態． 此外, 高濃度氧氣處理滯育卵也能有效阻斷蠶卵滯育[5-6]． 由于滯育對家蠶生長繁育的影響與蠶業生產相關, 滯育機制還未完全解析, 因此家蠶滯育研究一直是大家關注的焦點．

熱激蛋白(heat stress proteins, Hsps)廣泛存在于原核、 真核生物中, 最早在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發現[7]． 當生物遭受外界脅迫(如高溫)時, 體內細胞通過誘導合成熱激蛋白, 作為分子伴侶促進蛋白質的完整性和細胞穩態, 以抵御脅迫反應[8]． Hsps分子量差異較大, 可分為sHsps(small heat shock proteins), Hsp60, Hsp70以及Hsp90[9]． 熱激蛋白的存在反映了生物對環境中存在的某些極端應力的響應機制． 有研究表明, 熱激蛋白與昆蟲的滯育聯系緊密, 在滯育期間熱激蛋白基因表達產物通過增加、 減少或者維持不變來促進昆蟲在逆境中的生存[8]．

在前期研究中, 我們通過對家蠶滯育卵與發育卵轉錄組的研究分析[6], 發現了一些差異表達的熱激蛋白基因, 在這些基因中篩選出小分子熱激蛋白BmHsp19.1基因, 進行克隆、 生物信息分析以及在不同發育狀態蠶卵中的表達特征調查, 對該基因的功能進行了初步推導． 該結果為解析BmHsp19.1功能提供了有價值的信息, 為其他昆蟲sHsps的研究提供了一些參考．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗昆蟲

家蠶二化性品種大造(Dazao)由西南大學蠶桑紡織與生物質科學學院家蠶育種實驗室提供． 對母代胚胎進行25 ℃長光照、 15 ℃黑暗催青分別獲得滯育卵、 非滯育卵, 對其中的滯育卵進行高濃度氧氣處理、 HCl處理, 采集以上4種蠶卵產后0～7 d材料, 用液氮速凍, 保存于-80 ℃冰箱備用．

1.1.2 試劑耗材

RNAiso Plus, 反轉錄試劑盒, T4 DNA連接酶和pMD19-T載體, Takara; DNA聚合酶(2×Taq Master Mix), Novoprotein; 膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit), 廣州美基生物; 氨芐霉素, 上海生工; 宿主菌 BL21 (DE3)和大腸桿菌(Escherichiacoli) 感受態菌株Trans1-T1, 上海唯地生物; 引物合成和測序, 上海生工; 純氧氣瓶, 重慶強勝; HCl溶液, 重慶科試．

1.2 方法

1.2.1 高濃度氧氣處理及HCl處理

高濃度氧氣處理: 滯育卵產后20 h, 放置于25 ℃氧氣濃度為70%的三氣培養箱中處理40 h．

HCl處理: 滯育卵產后20 h, 室溫25 ℃條件下在比重為1.100的HCl溶液中浸泡70 min, 用流水洗凈, 晾干．

期間收集兩種處理產后2 d, 3 d, 5 d和7 d的蠶卵材料．

1.2.2 基因克隆鑒定和表達量檢測

利用報道過的BmHsp19.1基因序列在NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)以及SilkBase (http: //silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/)中進行檢索, 檢索之后用引物設計軟件Primer Premier (Version5.0)[10]設計BmHsp19.1熒光定量 PCR (qRT-PCR)引物、 克隆引物和內參引物 sw22671[11](表1)．

表1 引物序列

在BmHsp19.1載體構建實驗中, 以家蠶滯育卵7 d的cDNA作為模板進行PCR擴增． 循環參數為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 反應32個循環; 72 ℃終延伸10 min． 產物經1.5%瓊脂糖電泳后檢測其大小, 對目的DNA片段切膠回收, 再與pMD19-T載體連接, 將連接產物轉化到感受態細胞中, 通過菌液PCR篩選陽性克隆并進行測序鑒定．

以產后0 h, 20 h, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d家蠶滯育卵、 非滯育卵, 產后2 d, 3 d, 5 d, 7 d高濃度氧氣處理、 HCl處理的滯育卵的cDNA為模板開展qRT-PCR分析, qRT-PCR反應程序設定為94 ℃預變性1 min; 94 ℃反應20 s, 60 ℃反應40 s, 30個循環． 每個樣品3個生物學重復, 相對定量(2-ΔΔCT法)計算基因表達量．

1.2.3 蛋白的生物信息學分析

利用在線網站預測BmHsp19.1的信號肽區域(https: //services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-5.0)和磷酸化位點以及糖基化位點(https: // prosite.expasy.org/), 采用在線網站(http: //smart.embl-heidelberg.de/) 預測結構域, 采用在線網站(http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白跨膜結構域, 利用在線網站expasy (https: //web.expasy.org/protscale/)對蛋白親疏水性進行預測． 以BmHsp19.1為檢索序列, 采用NCBI(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)blast工具收集部分生物的sHsps序列, 在TBtools軟件中進行建樹, 建樹方法為最大似然法, 檢驗5 000次． 采用SilkDB 3.0(https: //silkdb. bioinfotoolkits. net/ main / species-info/-1)進行亞細胞定位, 利用在線網站PSIPRED v3.3 (http: //bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/)進行二級結構預測, 利用在線網站Robetta(https: //robetta.bakerlab.org/)對蛋白質的三維結構進行預測, 用PyMOLWin軟件制圖并導出．

1.2.4 統計分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件對數據結果進行統計分析, 采用two-way ANOVA方法檢驗比較不同樣品的差異顯著性(p<0.05)．

2 結果與分析

2.1 BmHsp19.1基因克隆與分析

對BmHsp19.1基因進行克隆, 以家蠶品種大造滯育卵7 d 的cDNA為模板, 用基因的克隆引物進行PCR擴增, 產物的大小采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測． 結果顯示, 在500～750 bp之間有1條特異性條帶, 與預期片段大小相符(圖1a)． 對該PCR產物進行切膠回收, 連接轉化pMD19-T載體, 篩選出陽性克隆進行測序, 得到CDS長度為507 bp核苷酸序列, 編碼168個氨基酸, 無信號肽結構, 無跨膜結構域, 在第56～152個氨基酸位具備Hsp20功能結構域, 屬于小分子熱激蛋白家族(圖1b)． 比對結果表明,BmHsp19.1基因克隆序列和家蠶SilkDB數據庫預測基因序列一致．

a圖中M為DL2000 Marker, 1為PCR擴增產物; b圖中Hsp20功能結構域以灰色顯示．圖1 BmHsp19.1基因

2.2 BmHsp19.1蛋白序列分析

BmHsp19.1蛋白預測的分子量為19.06 kDa, 等電點為5.59, 具有5個潛在的磷酸化修飾位點(T-29, S-56, T-79, S-117和S-143), 無糖基化位點． 利用ProtScale軟件進行蛋白親疏水性分析, 結果顯示: BmHsp19.1蛋白親水性氨基酸在整個肽鏈中的分布占比較多(圖2a), 疏水性氨基酸相對較少, 分別占總氨基酸的68.45%和31.55%． 23～41區域、 81～89區域、 128～138區域的氨基酸疏水性較強, 其中, 疏水性最強的氨基酸在第132位, 分值為1.422; 親水性較強的氨基酸集中分布在9～22區域、 34～35區域、 42～69區域、 71～77區域、 90～122區域、 139～152區域、 154～164區域, 其中親水性最強的氨基酸在第96位, 分值為-3.522． 通過PSIPRED v3.3和Robetta在線網站對蛋白的二級(圖2b)、 三級結構進行預測(圖2c), 其中, 蛋白結構中無規則卷曲所占比例最大, 為58.4%, β折疊占31.5%, α螺旋占10.1%．

圖2 BmHsp19.1蛋白

2.3 BmHsp19.1進化分析

利用Mega X軟件對20種不同物種的小分子熱激蛋白構建系統進化樹, 結果顯示, 選用的物種形成脊椎動物和無脊椎動物兩個大的分支, 其中家蠶和野桑蠶的親緣關系最近, 然后再與其他鱗翅目昆蟲聚在一起(圖3)．

圖3 sHsps系統發育進化樹

2.4 BmHsp19.1基因在蠶卵中的表達分析

為了調查家蠶BmHsp19.1基因在滯育卵、 非滯育卵、 高濃度氧氣處理的滯育卵和HCl處理的滯育卵中的表達情況, 采用qRT-PCR方法對其蠶卵進行分析(圖4)． 結果表明:BmHsp19.1基因在滯育卵和非滯育卵產后0～2 d的表達量較小, 差異不大; 滯育卵的表達量在產后3～7 d上調, 顯著高于非滯育卵． 在滯育卵、 高氧處理組和HCl處理組的比較中,BmHsp19.1基因的表達量也是在滯育卵中產后3 d開始上調, 顯著高于其余處理組, 并持續到產后7 d． 說明BmHsp19.1基因主要在蠶卵進入滯育過程的后期高量表達, 暗示該基因可能在進入滯育過程中起到了很重要的作用．

***表示p< 0.001, 差異有統計學意義．圖4 家蠶BmHsp19.1基因在不同發育狀態蠶卵中的表達量分析

3 討論

本研究中我們聚焦可能與滯育有關的Hsps家族蛋白, 這類蛋白通常在昆蟲經歷高溫、 寒冷、 缺氧等外界不利條件時產生并發揮作用, 其中Hsp60, Hsp70和Hsp90的分子量較大, 依賴于ATP發揮作用; 而sHsps家族蛋白, 其分子量介于12～43 kDa之間, 通常在30 kDa以下, 蛋白有保守的二級結構和蛋白結構域, 不依賴ATP發揮作用[8,12]． 本文中鑒定的BmHsp19.1基因, 其蛋白分子量為19.06 kDa, 具有典型的Hsp20功能結構域, 屬于小分子熱激蛋白家族．

滯育是昆蟲經歷的一個特殊的生理環境, 是生命活動由旺盛到幾乎停滯的過程[13]． 由于呼吸的減弱生物會進入到一個生理性缺氧的狀態, 這與外界條件缺氧環境很相似． 已有研究發現, 蟋蟀(Allonemobiussocius)在卵滯育時具有代謝減少64%的特征,Hsp20.7和Hsp90的mRNA表達量相對于非滯育的卵減少, 而Hsp70的mRNA表達量沒有變化[14-15]． 苜蓿切葉蜂(Megachilerotundata)滯育蛹中Hsp70的表達量明顯上調, 但Hsc70和Hsp90表達量的變化很小[16]． 有意思的是, 果蠅成蟲在缺氧過程中會上調至少4個Hsps基因, 包括Hsp23,Hsp67Bc,Hsp68和Hsp40, 其中Hsp23對缺氧最敏感[17]． 受缺氧影響的肥須麻蠅(Sarcophagacrassipalpis)成蟲增加了Hsps基因的表達:Hsp70對缺氧反應最迅速, 并且表現出最大的表達, 其次是sHsps基因(Hsp18,Hsp23和Hsp25), 然后是Hsp40和Hsp60[18]． 從中可以看出, 無論是滯育還是缺氧環境, 熱激蛋白都做出了壓力反應, 其中小熱激蛋白表現為普遍上調．

家蠶在胚胎早期進入滯育, 以滯育卵的形式度過寒冷的冬季． 科研工作者通過組學的方法對家蠶中的Hsps進行了廣泛的鑒定[6, 19-20], 其中與家蠶滯育相關的Hsps有Hsp60,Hsp70,DnaJ,Hsp83,Hsp90,sHsps有Hsp12.2-like,Hsp19.1,Hsp19.9,Hsp20.1,Hsp20.4,Hsp20.8,Hsp23.7． 由于滯育過程中能量代謝被抑制, 產生的ATP顯著下降, 此時不依賴于ATP的sHsps在滯育過程中大量積累． 有研究表明Hsp12.2-like,Hsp19.5在滯育卵中上調表達[6,21], 本研究中的BmHsp19.1基因在家蠶滯育進入過程中也呈現出上調表達的趨勢． 這些sHsps與細胞中存儲的蛋白質結合, 可以起到防止蛋白不可逆變性的保護作用, 這是細胞在滯育期間抵御壓力引起的蛋白質損失的首要反應[22-23]． sHsps反應迅速還在于其可以通過轉錄后修飾, 如磷酸化等來調節蛋白活性, 無需從頭合成蛋白． 在這方面研究最廣泛的例子是人類Hsp27, 其N末端區域內有3個磷酸化位點(Ser-15, Ser-78和Ser-82), 通過絲裂原活化蛋白激酶級聯調控進行修飾[12,24], 而本研究中BmHsp19.1預測的磷酸酸化位點多達5個(T-29, S-56, T-79, S-117和S-143), 暗示該蛋白可能通過蛋白修飾活化進而發揮功能． 有研究表明sHsps在正常和應激條件下, 細胞內定位是不同的[25-26], 而該蛋白在不同條件下的亞細胞定位, 有待進一步實驗證實．

綜上所述, 本研究成功地對BmHsp19.1基因進行了鑒定和在蠶卵中的表達分析, 該結果豐富了家蠶Hsps基因家族的研究信息, 下一步將獲取較純的BmHsp19.1蛋白, 作為研究滯育卵和非滯育卵差異的候選基因, 后續可采用RNAi干擾或基因編輯的方法對其開展功能研究．