基于網絡藥理學和細胞實驗探究復方散熱顆粒治療流行性感冒的作用機制

王雪萌, 蘇文靈, 王 玥, 宋端慧, 鄭瑞芳, 胡 旭, 邢建國

(1石河子大學藥學院, 新疆 石河子 832002; 2新疆維吾爾自治區藥物研究所, 烏魯木齊 830004;3新疆維吾爾藥重點實驗室, 烏魯木齊 830002)

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的一種傳染性呼吸系統疾病,可通過飛沫及接觸污染物在人群密集區域迅速傳播,其主要癥狀包括發熱、咽痛、咳嗽等,并可能引起病毒性心肌炎、病毒性腦炎等并發癥[1]。目前流感的防治方式主要包括疫苗的接種和抗病毒藥物的防治[2],其中,疫苗接種后通過被動免疫發揮防治效果,其制備方法需根據病毒的變異不斷更新,且研發周期較長[3];抗病毒藥物主要通過干預病毒裂解周期的不同階段發揮作用,目前常用的抗流感藥物包括基質蛋白2 (M2)抑制劑、神經氨酸酶(NA)抑制劑等。研究發現NA抑制劑奧司他韋和扎那米韋對兩株NA抑制劑耐藥性H7N9毒株中不能發揮治療效果,且流感病毒逐漸進化出對M2抑制劑金剛烷胺和金剛乙胺的耐藥性[4]。因此,研究開發新型流感治療藥物迫在眉睫。復方散熱顆粒(CSG)由菊苣子(seeds ofCichoriumglandulosumBoiss. et Huet.)、睡蓮花(NymphaeacandidaC.Presl)、天山堇菜(ViolatianschanicaMaxim.)、地錦草(EuphorbiahumifusaWilld. orEuphorbiamaculataL.)等9味藥材組成,具有退熱、保肝、利尿、宣肺止咳的功效,臨床上主要應用于病毒性呼吸道感染的預防和治療。本研究采用網絡藥理學和分子對接技術,收集和篩選復方散熱顆粒抗流感作用的活性成分及其潛在靶點,預測該復方應用于流感治療的主要分子機制,并通過細胞實驗進行初步驗證,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥復方散熱顆粒(新疆維吾爾自治區藥物研究所,20221228),磷酸奧司他韋顆粒(宜昌東陽光長江藥業股份有限公司,國藥準字H20080763),p-PI3K抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司,AP0854),PI3K抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司,A0982),p-AKT1抗體 (武漢愛博泰克生物科技有限公司,AP0140),AKT1抗體 (武漢愛博泰克生物科技有限公司,A11016),MMP9抗體(英國Abcam公司,ab38898),GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,60004-1-lg),HRP標記的山羊抗兔IgG (中杉金橋公司,ZB-2301),TNF-α ELISA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,ECTNF),IL-6 ELISA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,ECIL6),IL-1β ELISA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,ECIL1B),RIPA(強)裂解液(北京索萊寶科技有限公司,R0010),PMSF(北京索萊寶科技有限公司,P0100),CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,AR1199),廣譜磷酸酶抑制劑(武漢博士德生物工程有限公司,AR1183),BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,23227),DMEM培養基(美國HyClone公司,SH30262.01),0.25%胰酶-EDTA溶液(美國HyClone公司,SH30042.01)和胎牛血清(簡稱FBS, 美國HyClone公司,SH30084.02)。

1.2 儀器HERA cell-150i細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司),Evos FLoid細胞成像工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司),A2型生物安全柜(美國Thermo Fisher Scientific公司),SPARK 20M多功能微孔板檢測儀(瑞士TECAN公司),Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽 (美國Bio-Rad公司),PowerPacTM通用電泳儀(美國Bio-Rad公司),TGL-16K高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3 病毒及細胞株甲型流感病毒A/PR/8/34鼠適應株(H1N1)及MDCK細胞株均由中國疾病預防與控制中心病毒病預防與控制研究所提供。

1.4 復方散熱顆粒成分的收集與篩選通過中藥綜合數據庫(TCMID數據庫,http://www.megabionet.org/tcmid/)、 中藥分子機制生物信息學分析工具 (BATMAN-TCM數據庫,http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP數據庫,https://tcmsp-e.com/)收集本復方所有藥材的化學成分,然后經PubChem網站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取各成分3D結構及SMILES號,再將其輸入在SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/),以生物利用度得分(Bioavailability Score)≥0.5、胃腸吸收度(GI absorption)高(High)、類藥性(Druglikeness)中至少滿足2項規則進行成分篩選,得到潛在活性成分。

1.5 復方散熱顆粒靶點的篩選采用SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行潛在活性化學成分靶點預測,以可能性≥0.1為靶點篩選條件,匯總篩選結果,形成靶點集。

1.6 流感相關靶點的獲取以“流感”為關鍵詞,從在線人類孟德爾遺傳數據庫 (OMIM數據庫,https://omim.org/)、DrugBank數據庫(https://go.drugbank.com/)和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中檢索與該疾病相關的靶點,匯總得到疾病相關靶點集。

1.7 蛋白相互作用(PPI)網絡的構建采用Venny2.1.0將復方散熱顆粒潛在活性成分靶點集和流感相關靶點集取交集,得到復方成分與疾病的共同靶點。將獲取的共同靶點輸入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),將物種來源設置為Homosapiens,將最低相互作用得分設為0.9,篩選潛在靶點,構建PPI網絡。根據結果篩選出含有潛在靶點的化學成分,即為本復方的活性成分。將PPI網絡導入Cytoscape3.9.0軟件,通過其插件CytoHubba中MCC算法進行拓撲學分析,得到關鍵子網絡及核心靶點。

1.8 藥材-成分-靶點(HCT)網絡構建在獲得復方散熱顆粒活性成分、成分-疾病共同靶點以及其相互關系的基礎上,運用Cytoscape3.9.0軟件構建HCT網絡,采用Cytoscape中的網絡分析工具進行拓撲特征分析,并以Degree值為參考,篩選出關鍵成分。

1.9 GO功能富集和KEGG通路富集分析采用R 4.2.1及相關R包,對“1.4”項下獲得的潛在靶點進行基因本體論(GO)富集分析,該環節主要包括生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF);通過京都基因和基因組數據庫(KEGG)進行通路富集分析,數據統計限為P<0.05,q<0.2。將富集分析結果的前30項分別進行可視化。

1.10 分子對接驗證從蛋白質結構數據庫(PDB數據庫,https://www.rcsb.org/)中獲取“1.7”項下獲得的核心靶點3D結構,從TCMSP數據庫下載前文1.8項下的關鍵成分3D結構。采用Pymol 2.5.0軟件進行受體蛋白結構預處理,在Autodock 4.2.6軟件中分別導入核心靶點蛋白結構和關鍵成分結構進行分子對接,采用遺傳算法預測其最佳構象,采用Pymol軟件對結合能最低的5項進行可視化。

1.11 體外細胞實驗方法

1.11.1 藥物提取物的制備 采用DMSO溶液,將復方散熱顆粒(CSG)配置成濃度為50 mg/mL的儲備液。臨用前用細胞維持液稀釋至所需濃度。

1.11.2 細胞及病毒培養 采用含10%FBS的DMEM培養基作為細胞維持液,進行MDCK細胞培養,并將其置于37℃,5%CO2的細胞培養箱中。流感病毒株采用9日齡SPF級雞胚傳代,采用Reed-Muench法測定病毒在MDCK細胞中的半數組織培養感染劑量(TCID50)為1×105TCID50/mL。

1.11.3 藥物細胞毒性實驗 取對數生長期MDCK細胞,以2×104個/孔接種于96孔板中,培養24 h后,棄去原培養液,加入采用細胞維持液稀釋的不同濃度的藥物稀釋液(0.625～2 560 μg/mL,每孔100 μL,同時設正常細胞對照組、空白對照組,培養48 h后,加入含10%CCK-8溶液的細胞維持液,于37℃培養箱中孵育2 h,孵育結束后,在450 nm波長處進行吸光度的檢測,根據下式計算細胞存活率,確定50%細胞毒性濃度(TC50)。

1.11.4 藥物抗流感病毒實驗 取對數生長期MDCK細胞,以2×104個/孔接種于96孔板中。待細胞貼壁后,分別加入采用細胞維持液倍比稀釋至不同濃度的藥物稀釋液(10～60 μg/mL),同時設流感病毒(IFV)對照孔(僅加入病毒懸液)、正常對照孔(僅用細胞維持液培養),培養24 h后,棄去原培養液,每孔加入100 μL含100 TCID50的流感病毒懸液,感染2 h后,棄去病毒懸液,繼續孵育24 h后,根據“1.11.3”項下方法進行CCK-8檢測,根據下式計算病毒抑制率,確定本藥物的半數效應濃度(EC50)。

1.11.5 ELISA檢測細胞上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平 取對數生長期MDCK細胞,以5×105個/孔接種于6孔板,待細胞貼壁后,將其隨機分為對照組(Control)、IFV感染模型組(Model)、CSG給藥組(35、70、140 μg/mL)和陽性藥組(磷酸奧司他韋,OP),CSG給藥組加入不同濃度的CSG作用24 h,同時陽性藥組加入60 μg/mL OP作用24 h后,棄去原培養液,除對照組外,每孔加入100 μL含100 TCID50的流感病毒懸液,感染2 h后,棄去病毒懸液,繼續孵育24 h,收集細胞上清,采用ELISA檢測試劑盒檢測行TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.11.6 免疫印跡法(Western blot)檢測相關蛋白表達水平 取對數生長期MDCK細胞,以5×105個/孔接種于6孔板,待細胞貼壁后,根據“1.11.5”項下方法分組并造模,造模結束后,棄去培養液,用PBS洗滌2次,加入含1%PMSF和1%蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA(強)裂解液,冰上裂解30 min,再于12 000 r/min低溫離心20 min。離心結束后,收集上清,采用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣品蛋白濃度,按比例加入上樣緩沖液,進行金屬浴使樣品蛋白變性,短期存儲于-20℃。樣品經SDS-PAGE凝膠電泳后,電轉至PVDF膜,然后采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結束后,采用1×TBST洗滌3次,再分別加入p-PI3K、PI3K、p-AKT1、AKT1、MMP9、GAPDH抗體,于4℃孵育過夜,用1×TBST洗滌3次,加入相應的HRP標記的IgG二抗室溫孵育2 h,孵育結束后,用ECL發光液顯影,采用化學發光成像系統進行拍照,采用Image J軟件分析條帶灰度。

2 結果

2.1 復方散熱顆粒的潛在活性成分通過SwissADME平臺篩選從數據庫及文獻中檢索到的藥材成分,獲得復方散熱顆粒潛在活性成分553個,其中包括槲皮素、山柰酚、芹菜素等包含于若干味藥材中的共同成分。

2.2 復方散熱顆粒抗流感的潛在靶點通過SwissTargetPrediction平臺預測并篩選靶點,得到1 040個復方潛在活性成分靶點。采用疾病數據庫檢索及篩選,獲得流感相關靶點946個。將二者通過Venny軟件取交集,得到潛在共同靶點181個(圖1)。

圖1 復方散熱顆粒潛在活性成分靶點與流感相關靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡的構建與分析將潛在共同靶點上傳至STRING數據庫,通過設置參數范圍篩選得到共同靶點145個。繪制PPI網絡圖,其含有145個節點,2165條邊(圖2)。采用Cytoscape插件CytoHubba進行MCC分析,獲得關鍵子網絡,以排名前十的靶點為核心靶點,包括AKT1、JUN、GAPDH、STAT3、CASP3、TNF、IL6、MMP9、PTGS2、IL1B(圖3)。

圖2 復方散熱顆粒-流感潛在靶點PPI網絡圖

圖3 復方散熱顆粒核心靶點圖

2.4 HCT網絡的構建根據共同靶點進一步篩選本復方成分,得到復方散熱顆粒活性成分224個。將復方-疾病共同靶點、活性成分、復方藥材以及其相互關系導入Cytoscape,構建藥材-成分-靶點(HCT)網絡圖(圖4)。結果顯示,該HCT網絡共有378個節點,3 587條邊。圖中紫色菱形節點為復方-疾病共同靶點,黃色圓形節點表示復方藥材,六邊形節點為活性成分;節點的大小和透明度與反映節點在網絡中重要程度的Degree值有關,Degree值越大,節點越大,顏色越深。根據結果,選擇該值較高的活性成分為關鍵成分,包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素和白楊素。

圖4 藥材-成分-靶點(HCT)網絡圖

2.5 GO及KEGG通路富集分析設定參數范圍后,采用R語言對復方-疾病共同靶點進行GO富集分析(包括BP、CC和MF3個模塊)和KEGG通路富集分析。根據結果,分別選擇顯著性差異排名前30項繪制柱形圖(圖5A,B,C)和氣泡圖(圖5D),并將KEGG富集分析結果的前30項通路及其涉及的靶點以及與之相關的成分和相互關系導入Cytoscape,構建成分-靶點-通路(CTP)網絡(圖6)。該CTP網絡有331個節點和2 381條邊,圖中淺藍色圓角矩形節點表示前30項通路,深藍色菱形節點為通路富集匯總靶點,綠色六邊形節點為匯總靶點對應的化學成分;節點的大小和透明度與網絡Degree值有關,Degree值越大,節點越大,顏色越深。富集分析結果表明,共同靶點參與的生物過程主要包括細菌來源分子反應、氧水平反應、外源性刺激反應等;細胞組成分析表明,共同靶點主要位于膜微區、脂筏、質膜外側等區域;分子功能分析顯示出共同靶點主要在泛素樣蛋白連接酶結合、血紅素結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等反應中發揮作用;共同靶點參與的流感相關通路包括甲型流感(甲流)通路、C型凝集素受體(CLRs)信號通路、Toll樣受體(TLRs)信號通路等。

(A):生物過程;(B):細胞組成;(C):分子功能;(D):KEGG分析

圖6 成分-靶點-通路(CTP)網絡圖

2.6 分子對接結果采用AutoDock對核心靶點和關鍵成分進行分子對接,對接結果如圖所示(圖7)。結合能最低的5種成分為白楊素、芹菜素和木犀草素分別與MMP9對接,以及木犀草素、芹菜素分別與AKT1對接。將該5項對接結果的最佳構象分別導入Pymol進行可視化(圖8)。根據對接及可視化結果,白楊素、芹菜素、木犀草素分別與MMP9對接均與受體蛋白ARG-424和PRO-415殘基生成的氫鍵,表明三者靶向MMP9的活性位點可能相同。同樣,木犀草素和芹菜素分別與AKT1進行對接的結果中也存在相同的受體蛋白殘基SER-205、ASN-53、LYS-268和ILE-290與配體分子形成氫鍵,表明二者靶向AKT1的相同活性位點。

圖7 核心靶點與關鍵成分對接結合能

(A):白楊素與MMP9;(B):芹菜素與MMP9;(C):木犀草素與MMP9;(D):木犀草素與AKT1;(E):芹菜素與AKT1

2.7 細胞實驗結果

2.7.1 CSG體外抗流感作用 為尋找合適的藥物濃度進行后續實驗,對CSG作用于MDCK細胞后的細胞活力進行檢測,結果如圖所示(圖9),通過計算得出CSG對MDCK細胞的TC50為463.9 μg/mL。為確定CSG是否具有抗流感病毒的潛力,本實驗通過藥物預處理后,進行流感病毒感染細胞的方式進行研究。結果如圖所示(圖10),藥物預處理具有抗流感病毒活性,且其抗病毒作用呈劑量依賴性遞增。通過計算,CSG對H1N1流感病毒感染的EC50為70.51 μg/mL。

圖9 CSG對MDCK細胞活力的影響

圖10 CSG對流感病毒抑制率的影響

2.7.2 CSG對流感病毒感染MDCK細胞炎性因子水平的影響 由于流感會引起炎癥反應,因此,收集細胞上清,采用ELISA試劑盒進行炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的檢測。結果如圖所示(圖11),與對照組相比,模型組的TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著上升(P<0.01)。與模型組相比,采用CSG預處理后TNF-α、IL-1β和IL-6水平呈劑量依賴性遞減,且高劑量組的抑制炎癥因子釋放效果最為明顯(P<0.01),并與奧司他韋接近。

(A) (B) (C)

2.7.3 CSG對流感病毒感染MDCK細胞相關蛋白表達的影響 通過對p-AKT1/AKT1、MMP9和p-PI3K/PI3K蛋白表達的檢測,進一步探索CSG防治流感的作用機制。結果如圖所示(圖12),與對照組相比,流感病毒感染MDCK細胞后導致其MMP9表達明顯增多(P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1比值亦顯著升高(P<0.01)。與模型組相比, CSG預處理能夠顯著下調MMP9蛋白的表達水平,p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1比值明顯下降。

(A):各組p-PI3K、PI3K、p-AKT1、AKT1、MMP9、GAPDH的蛋白電泳圖;(B):p-PI3K與PI3K的蛋白表達量比值;(C):p-AKT1與AKT1的蛋白表達量比值;(D),MMP9與GAPDH的蛋白表達量比值

3 討論

本研究篩選得到復方散熱顆粒關鍵成分中,槲皮素、木犀草素、白楊素具有抑制流感病毒的作用[5-7],山奈酚和芹菜素具有抗炎功效[8-9]。復方核心靶點相互關聯,如CASP3、TNF和PTGS2三個核心靶點均參與免疫調節過程的重要通路白介素-17 (IL-17)信號通路[10]。KEGG富集和GO富集分析結果表明,復方散熱顆粒主要通過調控甲流通路、CLRs信號通路和TLRs信號通路發揮流感治療作用。研究表明,流感病毒經機體識別后,會激發先天免疫反應,激活介導干擾素產生的JAK-STAT通路[11],在先天免疫反應中發揮關鍵作用的NOD樣受體信號通路[12]引發多級反應,而甲流病毒作為流感病毒中的一類,其涉及的通路同樣涉及該類病毒感染所激活的復雜的生物過程。CLRs和TLRs主要通過NF-κB和MAPK通路引發下游反應誘導炎性因子的產生[13-14],Shi等[15]通過實驗觀察到抑制MyD88依賴型TLR7信號通路能夠下調NF-κB活性,從而減輕流感病毒誘導的小鼠體內促炎細胞因子過度表達。因此,復方散熱顆粒可能通過干擾病毒入侵和減輕過度炎癥反應發揮防治流感的作用。

根據分子對接結果,關鍵成分與MMP9、AKT1對接后表現出良好的親和性。Takahashi等[16]發現甲流病毒能夠上調MMP9,促進炎癥細胞的遷移,而通過抑制MMP9能夠減輕甲流感染小鼠心臟和肺部的炎癥反應;Denisova等[17]發現流感病毒感染能夠激活PI3K/AKT通路,該通路可介導免疫反應及參與炎癥反應,而PI3K或其下游信號AKT的抑制劑可以顯著阻斷流感病毒的入侵和復制。結合本研究的富集分析與核心子網絡分析結果,推測CSG可能通過干預促進炎性因子釋放的上游信號通路發揮抗流感作用,因此,本研究通過細胞實驗進一步探討CSG防治流感的作用效果與相關機制以及MMP9和AKT1作為流感治療潛在靶點的可行性。由于流感病毒能夠觸發免疫系統攻擊并激活炎癥通路[18],本研究通過檢測炎性因子水平,發現CSG預處理可明顯降低IFV感染細胞炎性因子的釋放,證明CSG預處理對IFV感染細胞發揮了保護作用。同時,本研究通過檢測相關蛋白表達水平,發現IFV感染細胞中顯著增加的p-PI3K、p-AKT1和MMP9的蛋白表達水平經CSG預處理后明顯降低,表明CSG可能通過調節PI3K/AKT通路抑制炎癥反應,減少炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放和抑制MMP9表達,發揮對流感病毒感染細胞的保護作用。

綜上所述,本研究基于網絡藥理學探討復方散熱顆粒應用于流感治療的潛在機制,共篩選得到224個活性成分,145個潛在靶點,這些活性成分及其潛在靶點通過若干相互關聯的信號通路發揮治療流感的作用,通過分子對接探究了本復方治療流感的潛在靶點,經細胞實驗初步驗證預測機制,為本復方流感治療機制的研究奠定了基礎。