基于不同型號(hào)熒光定量PCR儀比對(duì)HBV DNA檢測(cè)結(jié)果的一致性分析〔1〕

雷 艷,金鄭寶,詹世淮,王佳偉,孫春萍,張勝行

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院,福建 福州 350000)

乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)病毒(HBV)感染仍然是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題,目前HBV感染所致的肝硬化與肝癌是第十大死亡原因[1]。在過(guò)去的30年,得益于乙肝疫苗的接種,HBV表面抗原(HBsAg)的陽(yáng)性率從1992年的約9.75%降至2014年的不到3.00%[2],然而基于中國(guó)人口眾多,仍約有8 000萬(wàn)人HBsAg陽(yáng)性。乙肝病毒DNA是病毒存在的直接依據(jù),HBV DNA是病毒復(fù)制的標(biāo)志。按照ISO15189《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》要求,同一臨床PCR實(shí)驗(yàn)室采用不同儀器進(jìn)行同一項(xiàng)目的檢測(cè),應(yīng)比對(duì)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果的一致性[3]。本文按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)EP9-A3的文件要求[3],對(duì)實(shí)驗(yàn)室ABI-7500和ABI-ViiA7 Dx定量PCR儀檢測(cè)HBV DNA定量結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和偏移評(píng)估,評(píng)價(jià)其檢測(cè)結(jié)果的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

參加并通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)的ABI-7500 PCR儀為參比儀器,ABI-ViiA7 Dx熒光定量PCR儀為實(shí)驗(yàn)儀器。其他儀器包括:H-100型恒溫金屬浴、Sigma1-16K高速冷凍離心機(jī)、湖南湘儀有限公司CTK80自動(dòng)脫蓋離心機(jī)、北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司CLASS Ⅱ TYPE B2生物安全柜。

1.1.2 試劑

中山大學(xué)達(dá)安基因診斷公司提供的HBV DNA核酸定量檢測(cè)試劑(批號(hào)為2021013);標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品試劑盒自帶;廣州邦德盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒DNA低值S2和中值S4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品(批號(hào)為:2021001)。

1.1.3 標(biāo)本來(lái)源

收集本院2021年4月份門(mén)診和住院患者中無(wú)溶血、脂血、黃疸的新鮮血漿樣本,選取40份ABI-7500熒光定量PCR儀檢測(cè)過(guò)的HBV DNA陽(yáng)性血漿樣本分裝于1.5 mL EP管中,放于-20 ℃冰箱備用。HBV DNA濃度分布覆蓋整個(gè)線性范圍(102～108IU/mL)。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA核酸提取與擴(kuò)增

1.5 mL EP管中加入450 L DNA提取液,4 μL內(nèi)標(biāo)和200 μL經(jīng)3 500 r/min離心5 min后的臨床乙肝血漿樣本,振蕩混勻后置于100 ℃金屬浴10 min,12 000 r/min高速離心5 min,DNA上清備用。每次檢測(cè)均加入乙肝標(biāo)準(zhǔn)品(濃度2×103～2×106IU/mL)、陰性質(zhì)控品、空白以及邦德盛公司的強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性質(zhì)控品。緩慢吸取離心過(guò)的20 μL DNA上清液加入反應(yīng)管中,瞬時(shí)離心后放入PCR Ⅲ區(qū)的熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。

1.2.2 比對(duì)方法

按照NCCLS EP9-A3的文件建議,每天檢測(cè)10份樣本,連續(xù)檢測(cè)4 d,每份樣本均進(jìn)行雙孔平行測(cè)定。擴(kuò)增結(jié)束后將兩次測(cè)定結(jié)果轉(zhuǎn)化為10的對(duì)數(shù),取其平均值進(jìn)行儀器間的比對(duì)分析。通過(guò)計(jì)算線性回歸方程、顯著性分析和相對(duì)偏倚進(jìn)行HBV DNA結(jié)果比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.1 離群值檢驗(yàn)

按NCCLS EP9-A3文件進(jìn)行離群值檢驗(yàn),將所有檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化,以40份血漿樣本在兩臺(tái)儀器上測(cè)定差值的平均值的4倍作為離群值的判斷限,所有差值都在判斷限內(nèi)則無(wú)離群值。

1.3.2 兩臺(tái)儀器結(jié)果一致性分析

設(shè)定ABI-7500 PCR儀測(cè)定的濃度對(duì)數(shù)值為X值,在ABI-ViiA7 Dx上測(cè)定的濃度對(duì)數(shù)值為Y值,計(jì)算線性回歸方程:YABI-ViiA7Dx=aXABI-7500+b,并采用配對(duì)t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.3 計(jì)算不同儀器的相對(duì)偏倚

將兩臺(tái)儀器兩次重復(fù)測(cè)定HBV DNA結(jié)果轉(zhuǎn)化為10的對(duì)數(shù),分別計(jì)算兩臺(tái)儀器上檢測(cè)結(jié)果的平均值,相對(duì)偏倚(%)=(ABI-ViiA7 Dx檢測(cè)結(jié)果均值-ABI-7500檢測(cè)結(jié)果均值)/ABI-7500檢測(cè)結(jié)果均值×100%,相對(duì)偏倚<±7.5%則在臨床檢測(cè)結(jié)果可接受范圍內(nèi)[4]。

2 結(jié) 果

2.1 離群值檢驗(yàn)

ABI-7500差值的平均值為X′=0.123 6,ABI-ViiA7 Dx差值的平均值為Y′=0.186 5,離群值判斷限為0.494 4和0.746 0,結(jié)果表明兩臺(tái)儀器檢測(cè)HBV DNA的定量值均無(wú)離群(見(jiàn)圖1)。

圖1 40份臨床標(biāo)本濃度離群值

2.2 兩臺(tái)儀器間結(jié)果比較

對(duì)兩臺(tái)儀器測(cè)定的40份臨床樣本的HBV DNA定量結(jié)果配對(duì)t檢驗(yàn)分析可知P=0.256,P>0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明ABI-7500與ABI-ViiA7測(cè)定HBV DNA定量結(jié)果具有良好的一致性,符合臨床檢測(cè)的需要。

2.3 兩臺(tái)儀器結(jié)果一致性的比較

以ABI-7500檢測(cè)結(jié)果的對(duì)數(shù)值為X軸,以ABI-ViiA7 Dx檢測(cè)結(jié)果的對(duì)數(shù)值為Y軸,兩儀器檢測(cè)結(jié)果的線性回歸方程為YViiA7=0.998X7500+0.039 2(見(jiàn)圖2),r2=0.9919,r2>0.980,表明ABI-7500與ABI-ViiA7 Dx檢測(cè)HBV DNA的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

圖2 ABI-7500與ABI-ViiA7測(cè)定HBV DNA結(jié)果的一致性

2.4 計(jì)算相對(duì)偏倚

在兩臺(tái)定量PCR儀上測(cè)定的40份血漿樣本HBV DNA,相對(duì)偏倚均<±7.5%,符合ISO15189對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)要求,表明兩臺(tái)儀器均能用于HBV DNA定量檢測(cè)。

3 討 論

PCR技術(shù)自1985年由Kary Mullis開(kāi)發(fā)以來(lái),其在核酸檢測(cè)系統(tǒng)中的應(yīng)用徹底改變了DNA和RNA的定量分析。熒光定量PCR法檢測(cè)HBV能夠衡量患者體內(nèi)病毒DNA復(fù)制的活躍度及病毒載量的高低[4]。HBV DNA定量與肝炎病毒感染機(jī)體后疾病的進(jìn)程密切相關(guān),能反映患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制水平。HBV DNA陽(yáng)性是患者具有傳染性的標(biāo)志,DNA測(cè)定對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用,還能判斷肝功能異常是否由病毒引起[5],可評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效以及判定預(yù)后。臨床上將經(jīng)干擾素或拉咪呋啶治療后HBV DNA值小于103copies/mL作為陰性或臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)[6]。HBV DNA可檢出隱匿性慢性乙型肝炎,對(duì)乙肝病毒的防治具有重要作用。在HBV DNA的定量檢測(cè)過(guò)程中,不同型號(hào)PCR儀的光路系統(tǒng)或溫度模塊具有差異,HBV DNA在不同儀器上的定量值會(huì)有一定的偏差。隨著新的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒的增加,HBV DNA定量一直在不斷發(fā)展。Lall等[7]通過(guò)線性回歸的散點(diǎn)圖、精密度、靈敏度及最低檢測(cè)線等方面對(duì)不同定量試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證。本研究表明兩臺(tái)不同型號(hào)的熒光定量PCR儀測(cè)定40份臨床血漿樣本均無(wú)離群值出現(xiàn);線性回歸方程結(jié)果顯示r2=0.991 9,r2>0.980,表明兩臺(tái)儀器HBV DNA定量結(jié)果具有良好的相關(guān)性;兩儀器HBV DNA定量結(jié)果的相對(duì)偏倚均<±7.5%,檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。

綜上所述,ABI-7500和ABI-ViiA7 Dx可同時(shí)用于臨床HBV DNA定量檢測(cè)。