抗敏止嗽顆粒對哮喘小鼠PI3K/Akt通路和Th1/Th2的調(diào)控作用研究

崔建茹,孫美好,王蓓蕾,2,周慶偉,2

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046;2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

哮喘是一種異質(zhì)性慢性疾病,主要病理特征為氣道炎癥、可逆性氣道阻塞和氣道重塑,病程纏綿,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,甚至?xí)＜吧黐1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用支氣管擴張劑、糖皮質(zhì)激素治療哮喘,可控制哮喘發(fā)作,但長期用藥有明顯不良反應(yīng),影響患者用藥依從性[3]。中醫(yī)中藥治療有“標(biāo)本兼治”的特點,在哮喘等慢性疾病的治療中有著一定的優(yōu)勢[4-5]。抗敏止嗽顆粒是周慶偉教授在止嗽散的基礎(chǔ)上進行加減用于治療發(fā)作性哮喘的經(jīng)驗方,臨床證實該方藥可減輕氣道炎癥,降低氣道高反應(yīng)性[6],但其具體的作用機制尚不清楚。目前研究表明,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt) 信號通路的激活和Th1/Th2的失衡介導(dǎo)了哮喘氣道炎癥、氣道重塑等病理過程,進而加重哮喘,抑制該通路活化和調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡可有效控制哮喘發(fā)作[7-8]。故本實驗通過觀察抗敏止嗽顆粒對哮喘小鼠PI3K/Akt信號通路及Th1/Th2平衡的影響,探討了其作用機制,旨在為臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠48只,6～8周齡,體重(20±2)g,購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0001。小鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室,飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(24±1)℃,濕度(50±15)%,12 h明暗交替,自由進食飲水。本實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(YFYDW2020001)。

1.2藥品 抗敏止嗽顆粒,由炙麻黃10 g、炒紫蘇子15 g、紫蘇葉15 g、蜜紫菀15 g、蜜款冬花15 g、蜜枇杷葉15 g、防風(fēng)15 g、醋五味子15 g、烏梅20 g、地龍20 g、僵蠶20 g、蟬蛻20 g組成,配方顆粒劑由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。地塞米松片,新鄉(xiāng)市常樂制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H41020216,規(guī)格:0.75 mg/片。

1.3主要試劑及儀器 卵清白蛋白(OVA, Sigma,批號:SLCB8249),氫氧化鋁凝膠(Thermo,批號:VG304133),HE染色劑(批號:G1005)、Masson染色劑(批號:G1006)、RNA提取液(批號:G3013)、BCA試劑盒(批號:G2026)、β-actin(批號:GB12001)、PI3K抗體(批號:GB13471)、Akt抗體(批號:GB13427)、GAPDH(批號:GB11002)、白細(xì)胞介素-4(IL-4,批號:220419M)、干擾素-γ(IFN-γ,批號:220419M)均購自Servicebio公司。霧化器(成都維信,型號:CW2605C1 ),熒光定量PCR儀(Bio-rad,型號:CFX),超微量分光光度計(Thermo,型號:NanaDrop2000),酶標(biāo)儀(Rayto,型號:RT-6100),臺式高速冷凍離心機(DRAGONLAB,型號:D3024R)。

1.4實驗方法 將48只小鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、抗敏止嗽顆粒低劑量組、抗敏止嗽顆粒中劑量組、抗敏止嗽顆粒高劑量組和地塞米松組,每組8只。除空白組外,其余組小鼠分別于第1天、第7天腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(含 OVA 2.5 mg、氫氧化鋁100 mg、PBS 10 mL);實驗第15天開始,各造模組小鼠給予0.1%OVA霧化吸入30 min激發(fā)哮喘,1次/d,連續(xù)7 d。于實驗第15～21天霧化激發(fā)前1 h,抗敏止嗽顆粒低、中、高劑量組分別給予0.35 g/kg、0.7 g/kg、1.4 g/kg抗敏止嗽顆粒灌胃,地塞米松組給予地塞米松0.075 mg/kg灌胃,空白組和模型組給予蒸餾水灌胃。在實驗?zāi)┐戊F化激發(fā)24 h后進行取材。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1血清炎癥因子水平 各組小鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉后,摘眼球取血,于4 ℃下3 000 r/min離心15 min,取血清放置于-20 ℃凍存。按ELISA試劑盒說明書檢測IL-4、IFN-γ水平,計算IFN-γ/IL-4比值。

1.5.2肺組織病理形態(tài) 摘取各組小鼠肺組織,用4%多聚甲醛固定右肺中葉48 h,之后進行脫水包埋,切成5 μm厚薄片備用,蘇木素染色和0.5%伊紅染色,中性樹膠封片,晾干,置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)。將切片脫蠟至水,Masson染液浸染,1%鹽酸酒精分化,切片用1%冰醋酸漂洗分化,無水乙醇脫水,中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢和圖像采集分析。

1.5.3肺組織中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達情況 采用Western blot技術(shù)檢測:取0.1～0.2 g小鼠肺組織樣本,每100 mg樣本加入1 mL體積的RIPA裂解液,用勻漿器在冰上充分研磨勻漿,在4 ℃下裂解0.5 h, 超聲破碎儀破碎,4 ℃、12 000 r/min離心10 min, 取上清液,用BCA試劑盒測定肺組織蛋白濃度,之后采用5%SDS-PAGE 凝膠進行電泳分離,轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗孵育過夜后,二抗室溫下孵育30 min,之后洗滌條帶,加入ECL發(fā)光液進行曝光顯影,成像分析儀自動成像,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5.4肺組織中PI3K、Akt mRNA表達情況 采用熒光定量PCR技術(shù)檢測:取小鼠肺組織100 mg,TRIzol試劑從肺組織中提取總RNA,將總RNA濃度稀釋為100 μg/mL,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,將cDNA在熒光定量PCR系統(tǒng)中進行擴增反應(yīng)。PCR條件:90 ℃ 10 min預(yù)變性;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);65～95 ℃每升溫0.5 ℃采集1次熒光信號。最終數(shù)據(jù)按照ΔΔCT法進行處理分析。內(nèi)參基因和目的基因的引物序列見表1。

表1 內(nèi)參基因和目的基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比較 與空白組比較,模型組血清IL-4水平明顯升高(P<0.05),血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,抗敏止嗽顆粒各組和地塞米松組血清IL-4水平均明顯降低(P均<0.05),血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4均明顯升高(P均<0.05);與抗敏止嗽顆粒低劑量組比較,抗敏止嗽顆粒高劑量組和地塞米松組血清IL-4水平均更低(P均<0.05),血清IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4均明顯更高(P均<0.05)。見表2。

表2 空白組和哮喘各組小鼠血清IL-4、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較

2.2各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn) 空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常;模型組小鼠肺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁大面積中度增厚,肺泡間隔增寬;與模型組組比較,抗敏止嗽顆粒各組及地塞米松組小鼠炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁增厚和肺泡間隔增寬有不同程度的改善,其中抗敏止嗽顆粒高劑量組和地塞米松組改善更明顯。見圖1。

圖1 空白組和哮喘各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組小鼠肺組織Masson染色表現(xiàn) 空白組小鼠肺組織中僅有少量淡藍色膠原纖維沉積;模型組小鼠可見上皮細(xì)胞紊亂、脫落,氣道壁增厚,管腔狹窄,部分小血管形成和大量的膠原纖維沉積;抗敏止嗽顆粒各組及地塞米松組小鼠氣道壁增厚、管腔狹窄、小血管形成和膠原沉積情況較模型組明顯改善;抗敏止嗽顆粒高劑量組改善情況優(yōu)于抗敏止嗽顆粒低劑量組,但差于地塞米松組。見圖2。

圖2 空白組和哮喘各組小鼠肺組織Masson染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組小鼠肺組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達情況 模型組 p-Akt、p-PI3K蛋白相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05);抗敏止嗽顆粒各組及地塞米松組p-Akt、p-PI3K蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05),且抗敏止嗽顆粒高劑量組和地塞米松組均明顯低于抗敏止嗽顆粒低劑量組(P均<0.05)。見圖3及表3。

圖3 空白組和哮喘各組小鼠肺組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達情況

表3 空白組和哮喘各組小鼠肺組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相對表達量比較

2.5各組小鼠肺組織中PI3K、Akt mRNA表達情況模型組PI3K、Akt mRNA相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05);抗敏止嗽顆粒各組及地塞米松組PI3K、Akt mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05),且抗敏止嗽顆粒高劑量組PI3K mRNA相對表達量明顯低于抗敏止嗽顆粒低劑量組(P<0.05),抗敏止嗽顆粒高劑量組Akt mRNA相對表達量明顯高于抗敏止嗽顆粒低劑量組(P均<0.05)。見表4。

表4 空白組和哮喘各組小鼠肺組織中PI3K、Akt mRNA相對表達量比較

3 討 論

支氣管哮喘患者多表現(xiàn)為咳嗽陣發(fā)、咽癢即咳、氣急,遇到冷空氣、刺激性氣味常咳嗽突發(fā)或加重,且多為干咳或少痰,與中醫(yī)“風(fēng)勝則動”的觀點相符合。故周慶偉教授從“風(fēng)”論治支氣管哮喘,認(rèn)為“風(fēng)邪伏肺”為其根本病因,“痰、飲、瘀”為風(fēng)邪引動的病理產(chǎn)物,基于此創(chuàng)“抗敏止嗽顆粒”治療支氣管哮喘發(fā)作期。方中炙麻黃、蘇葉、蘇子、防風(fēng)疏風(fēng)宣肺,升陽散邪;炙枇杷葉、蜜款冬花、蜜紫菀化痰止咳,清肺降氣;因伏痰膠結(jié),宜蟲藥入絡(luò)搜邪[9],故以僵蠶、蟬蛻、地龍熄風(fēng)通絡(luò)止痙;風(fēng)邪化燥久戀傷陰,以五味子、烏梅生津潤肺、斂肺定喘;諸藥合用,散風(fēng)祛痰而不耗氣傷津,斂肺降氣而不留邪于內(nèi),共奏祛風(fēng)解痙、宣肺化痰之功效。

Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用是近年來的研究熱點。IL-4是Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子,哮喘發(fā)生時其可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體以及促進嗜酸性粒細(xì)胞增多,從而使肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯等,誘發(fā)氣道炎癥[10]。IFN-γ是Th1細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子,與IL-4相互拮抗[11]。哮喘發(fā)生時,患者體內(nèi)的Th1/Th2細(xì)胞因子偏移,IFN-γ分泌受到抑制,從而引起Th2的過度免疫,加重氣道炎癥[12]。本實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠血清IL-4水平明顯升高,血清IFN-γ水平明顯降低,肺部組織炎癥浸潤明顯,說明哮喘小鼠存在Th1/Th2 比例失衡,引發(fā)炎癥反應(yīng);抗敏止嗽顆粒各組血清IL-4水平明顯降低,血清IFN-γ水平明顯升高,肺組織炎癥浸潤明顯減輕,說明抗敏止嗽顆粒可調(diào)節(jié)Th1/Th2趨于平衡,從而減輕氣道炎癥。

PI3K/Akt信號通路與哮喘有著密切的關(guān)系[13]。PI3K/Akt信號通路及其下游信號因子可以通過促進Th2細(xì)胞的活化[14],調(diào)節(jié)自噬[15],參與調(diào)控核因子-κB[16]等機制,影響哮喘的發(fā)病。當(dāng)PI3K/Akt信號通路激活時,可以促進Th2細(xì)胞因子的釋放,誘發(fā)哮喘的氣道炎癥反應(yīng),引起氣道高反應(yīng)性[17]。而抑制PI3K/Akt信號通路可以減少肺組織中炎性細(xì)胞浸潤,減少膠原沉積,減輕氣道重塑[18-21]。因此抑制PI3K/Akt信號通路可能是治療呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病如哮喘的新療法。本實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠肺組織中可見膠原纖維沉積,肺組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量和PI3K、Akt mRNA相對表達量均明顯升高,提示哮喘小鼠PI3K/Akt信號通路被激活;抗敏止嗽顆粒各組肺組織中膠原纖維沉積減少,肺組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量和PI3K、Akt mRNA相對表達量均明顯降低,表明抗敏止嗽顆粒可通過抑制PI3K/Akt信號通路而減少膠原沉積,發(fā)揮治療哮喘的作用。

綜上所述,抗敏止嗽顆粒可以有效調(diào)節(jié)Th1/Th2比例失衡,增強Th1、抑制Th2的免疫應(yīng)答,從而減輕過敏性哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)和氣道重塑,其具體機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路相關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。