萱草花中黃酮、多酚和多糖的提取及抗氧化活性

孟慶然，錢一文，嚴 昊，張馨月，周芷汀，張志國，高文杰

（上海應用技術大學 a. 香料香精化妝品省部共建協同創新中心；b. 香料香精化妝品學部；c. 生態技術與工程學院，上海 201418）

萱草（Hemerocallis fulva），又稱忘憂草、宜男草等，是阿福花科萱草屬植物，原產于中國、日本、東南亞、西伯利亞等國家和地區。在中國古代的藥學著作中，萱草屬植物具有很高的藥用價值，可以起到助眠、保護肝臟、抗菌殺蟲、鎮靜安神等作用[1]。近年來，國內外學者研究發現，萱草提取物還具有抗氧化、抗抑郁、抗病毒、抗衰老、降血糖、降血壓、降血脂、免疫調節等多重功效[2-5]。然而，對于不同品種萱草花中不同功效成分含量及抗氧化活性的比較，仍缺乏相關研究。

植物中功效成分提取的方法眾多，包括回流提取、索氏抽提、超聲輔助提取、微波輔助提取、超臨界提取、亞臨界提取等[6-7]。周先泰等[8]以提取率為評價指標，采用超聲輔助法提取竹葉中的多糖，并測定竹葉多糖的抗氧化活性。蘇適等[9]以黑豆為原料，采用超聲波輔助提取法，研究了提取因素（離子液體濃度、提取時間、料液比和提取溫度）對黑豆異黃酮提取率的影響，并確定了最佳提取工藝。荊常亮[10]以紫花苜蓿為原料，以總黃酮含量為指標，采用回流法和超聲波輔助提取法確定了總黃酮最佳提取條件，并進行了抗氧化活性研究。

本實驗將采用超聲輔助提取工藝，分析10種不同品種萱草花中多糖、多酚和黃酮的含量，并用通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine, DPPH）自由基[11-12]和2,2＇-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2 '-diazodi-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid, ABTS自由基[13]清除實驗評價不同提取物的抗氧化活性。研究結果將為開發萱草花來源的天然抗氧化劑提供數據支撐，同時為科學合理的利用萱草種質資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萱草花：上海應用技術大學國家萱草種質資源庫；蘆丁標準品、沒食子酸標準品：上海邁瑞爾化學技術有限公司；抗壞血酸、福林酚試劑、苯酚（均為分析純）：上海泰坦科技股份有限公司； DPPH、ABTS：國藥集團化學試劑上海有限公司；實驗用水為實驗室自制去離子水；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-12N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；H2050R高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；U410超低溫冰箱：德國Eppendorf公司；UV-1800紫外分光光度計：日本Shimadzu公司；KH7200DE數控超聲波清洗機超聲清洗機：昆山禾創超聲儀器有限公司；DHG-9075A鼓風干燥箱：上海慧泰儀器制造有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 萱草花中多糖、多酚、黃酮的提取

原料預處理：處于盛花期的萱草花于2021年6月20日采摘于上海應用技術大學國家萱草種質資源庫（見圖1），所有樣品均為開花當日花（整朵花），且在同一天采收，每個品種設置3個重復。將新鮮采摘的樣品于-80 ℃條件下預凍12 h，然后置于冷凍干燥機中干燥72 h。凍干的樣品粉碎、過篩（80目）后置于干燥器中避光保存備用。

圖1 10個不同品種萱草花Fig. 1 10 different varieties of Hemerocallis fulva flowers

（1） 萱草花黃酮和多酚的提取。參考Musci等[14]的方法，并略作修改。準確稱取凍干樣品10 g，以1∶25的料液比加入無水乙醇，超聲輔助提取30 min。提取物 4 000 r/min離心15 min。上述步驟重復2次。合并濾液并減壓濃縮，濃縮液定容于250 mL容量瓶中，于-20 ℃環境中保存備用。

（2） 萱草花多糖的提取 。參考胡彥波等[15]的方法，并略作修改。取上述固體殘渣，置于60 ℃烘箱中干燥4 h。將烘干后的濾渣按照1∶25的料液比加入去離子水，置于超聲清洗機，超聲輔助提取40 min后置于80 ℃水浴中回流提取120 min。提取物于 4 000 r/min離心15 min，收集濾液。上述步驟重復2次，合并濾液并減壓濃縮至總體積的1/4。加入1/4體積的氯仿-正丁醇（4∶1）混合液，充分振搖30 min，4 000 r/min離心5 min，重復若干次至離心后中間無白色分層。收集水相，減壓濃縮至原體積的1/4，然后加入4倍體積的無水乙醇，混勻后放入4 ℃冰箱靜置24 h，4 000 r/min離心15 min。除去上清液，沉淀用80%的乙醇溶液洗滌3次，離心取沉淀，沉淀中加入蒸餾水溶解，然后置于-80 ℃冰箱中預凍12 h后冷凍干燥72 h即得多糖樣品。樣品置于干燥器中存儲備用。

1.3.2 黃酮含量的測定

參考Yang等[16]的方法，并稍作修改。準確稱取10 mg蘆丁標準品，用去離子水定容至100 mL，制得蘆丁標準液。從標準液中取2 mL于離心管中，采用倍比稀釋法將標準液稀釋成6個濃度。稀釋液加入5%的亞硝酸鈉溶液0.6 mL，搖勻后靜置5 min；然后加入10%的硝酸鋁溶液0.6 mL，搖勻后再次靜置5 min；最后加入10%的氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻后靜置20 min。以去離子水作參比溶液，于507 nm波長下測定反應后的吸光度。以蘆丁溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。準確量取提取樣品提取液（或稀釋液）2 mL，按上述步驟測定吸光度，并根據蘆丁標準曲線計算黃酮含量。

1.3.3 多酚含量測定

參考Musci等[14]的方法，稍作修改，采用福林酚比色法繪制多酚的標準曲線。準確稱取沒食子酸標準品50 mg，用甲醇定容至100 mL。從標準母液中取1 mL于離心管中，采用倍比稀釋法將標準液稀釋成6個濃度，然后加入福林酚溶液0.5 mL、10%的碳酸鈉溶液1.5 mL，充分混勻室溫下放置30 min。以甲醇作為參比溶液，于760 nm下測定吸光度，以沒食子酸溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線。準確量取樣品提取液（或稀釋液）1 mL，按上述步驟測定吸光度，并根據沒食子酸標準曲線計算多酚含量。

1.3.4 多糖含量測定

參考陸海勤等[17]的方法，并稍作修改。準確稱取干燥的標準葡萄糖10 mg，用去離子水定容至250 mL。依次移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL標準葡萄糖溶液置于離心管中，加入去離子水補至1.0 mL；分別加入5%苯酚0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，搖勻后沸水加熱15 min；反應后置于冰浴中快速冷卻。以去離子水作為參比溶液，于490 nm處測其吸光度值，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。準確量取一定量的多糖樣品，配置10 mg/mL的多糖母液。取上述母液（或稀釋液）1 mL，按上述步驟測定吸光度，并根據葡萄糖標準曲線計算多糖含量。

1.3.5 DPPH自由基清除實驗

準確稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL不同濃度的萱草花醇提液、多糖溶液或VC溶液（對照），分別加入2 mL的DPPH溶液，避光反應10 min、517 nm處測定反應液的吸光度值，按照下列公式計算各提取物的DPPH自由基清除率，同時計算半數抑制濃度IC50值

式中：A1為樣品溶液與DPPH溶液混合后在517 nm處吸光度；A2為樣品溶液與甲醇混合后在517 nm處吸光度；A0為甲醇在517 nm處吸光度。

1.3.6 ABTS自由基清除實驗

準確稱取30 mg的ABTS粉末，加入8 mL的無水乙醇，配制成ABTS儲備液。準確稱取10 mg的過硫酸鉀，加入15 mL的去離子水，搖勻，配制成過硫酸鉀儲備液。分別取上述ABTS儲備液和過硫酸鉀儲備液各2 mL，混合后置于避光環境下反應12 h，使用前將其稀釋50倍。取1 mL不同濃度萱草花醇提液、多糖溶液或VC溶液（對照品），分別加入2 mL的ABTS溶液，室溫下反應10 min，734 nm處測定吸光度，按照下列公式計算各提取物的DPPH自由基清除率，同時計算半數抑制濃度IC50值

式中：Ai為樣品溶液與ABTS溶液混合液在734 nm處的吸光度；A0為蒸餾水與ABTS溶液混合液在734 nm處的吸光度；Ai0為樣品溶液與蒸餾水混合液在734 nm處的吸光度。

1.4 數據統計與分析

圖表中數據均以平均值±標準偏差（M±SD）表示，所有實驗重復3次以上。圖采用Origin2018軟件（美國OriginLab公司）繪制；數據之間的顯著性采用SPSS13.0軟件（美國IBM公司）分析，其中P＜0.05表明差異顯著。

2 結果與討論

2.1 標準曲線結果

由圖2～4可見，本實驗中所需的黃酮（蘆丁）、多酚（沒食子酸）和多糖（葡萄糖）的標準線分別為：黃酮：y=0.014 6x+0.066 64，R2=0.996 6；多酚：y=0.082 2x+0.090 7，R2=0.999 9；多糖：y=0.015 9x-0.008 16，擬合度R2=0.998 8。3條標準曲線線性擬合良好（R2均大于0.99），可以滿足本實驗需求。

圖2 蘆丁（黃酮）標準曲線Fig. 2 Rutin (flavone) standard curve

圖3 沒食子酸（多酚）標準曲線Fig. 3 Gallic acid (polyphenol) standard curve

圖4 葡萄糖（多糖）標準曲線Fig. 4 Glucose (polysaccharide) standard curve

2.2 不同品種萱草花中多糖、黃酮和多酚的含量

由圖5可知，不同品種萱草花中多糖含量存在顯著差異。其中‘47號’和‘流星’含量最高，分別為8.290%和8.192%（p＞0.05）；‘星光玫瑰’、‘沙曼’和‘牧羊人’含量次之，分別為7.813%、7.219%和6.750%（p＞0.05）；‘凝望’、‘四十二街’和‘烈焰’含量分別為6.192%、6.015%和5.837%（p＞0.05）；‘自由行’和‘茉莉百合’多糖含量最低，分別為5.432%和5.376%（p＞0.05）。目前有關萱草花多糖的研究主要集中在可食用萱草品種黃花菜。陸海勤等[17]采用超聲協同高壓脈沖電場提取黃花菜多糖，多糖得率達10.03%，而周紀東等[18]采用正交試驗研究發現黃花菜中多糖含量高達14.92%，說明植物中多糖的含量可能受產地、生長環境及采后儲藏條件等影響。

圖5 不同品種萱草花中多糖、黃酮和多酚含量Fig. 5 Polysaccharides, flavone, and polyphenol content in different varieties of Hemerocallis fulva flowers

不同品種萱草花黃酮含量差異十分顯著（見圖5）。其中‘烈焰’含量最高，為17.43 mg/g，與含量最低的‘四十二街’，為2.567 mg/g，兩者之間差異近6.8倍（p＜0.05）；‘星光玫瑰’黃酮含量次之，為13.76 mg/g；‘牧羊人’和‘茉莉百合’含量分別為10.84 mg/g和10.57 mg/g（p＞0.05）；‘47號’和‘凝望’黃酮含量分別為9.998 mg/g和9.270 mg/g（p＞0.05），然后是‘流星’、‘沙曼’和‘自由行’，三者黃酮含量依次降低，分別為8.434 mg/g、6.710 mg/g和5.443 mg/g（p＜0.05）。于海燕等[19]研究發現，萱草花中黃酮含量高達51.60 mg/g；白雪松等[20]研究發現，可食用萱草花金針菜種黃酮的含量為0.536%，均高于本研究中萱草品種的黃酮含量。

不同品種萱草花中多酚含量存在顯著差異（見圖5）。其中‘烈焰’和‘星光玫瑰’含量最高，分別為15.21 mg/g和14.93 mg/g（p＞0.05）；‘47號’和‘茉莉百合’含量略有減少，分別為13.55 mg/g和13.37 mg/g（p＞0.05）；‘自由行’、‘牧羊人’和‘流星’含量其次，分別為11.51 mg/g、11.47 mg/g和10.81 mg/g（p＞0.05）；‘凝望’和‘四十二街’分別為10.60 mg/g，9.817 mg/g（p＞0.05）；而‘沙曼’多酚含量最低，為8.633 mg/g。

2.3 萱草花醇提物對DPPH自由基清除結果比較

如圖6所示，0～0.5 mg/mL濃度范圍內，DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而增加；當濃度＞0.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率趨于平緩。當濃度≥2 mg/mL時，‘沙曼’、‘47號’、‘茉莉百合’、‘牧羊人’、‘流星’、‘星光玫瑰’、‘四十二街’和‘凝望’等8個品種萱草花提取物的DPPH自由基清除能力和VC相當。10個品種提取物DPPH自由基清除率的IC50值見表1。

表1 不同品種萱草花醇提取物DPPH自由基和ABTS自由基清除率的IC50值Tab. 1 IC50 values of DPPH free radical and ABTS free radical scavenging rate of alcohol extract from different varieties of Hemerocallis fulva flowers

圖6 不同品種萱草花醇提取物DPPH自由基清除率Fig. 6 DPPH free radical scavenging rate of alcohol extract from different varieties of Hemerocallis fulva flowers

2.4 萱草花醇提物對ABTS自由基清除結果比較

如圖7所示，提取物的濃度＜1 mg/mL時，ABTS自由基清除率隨著萱草花醇提物濃度的提高而急劇增加；當濃度＞1 mg/mL時，‘牧羊人’、‘烈焰’、‘47號’以及‘茉莉百合’萱草花醇提取物對ABTS自由基的清除率達到平衡且與VC效果相當，而‘自由行’、‘星光玫瑰’、‘沙曼’、‘凝望’、‘流星’及‘四十二街’萱草花提取物對ABTS自由基的清除率先緩慢提高然后趨于穩定。研究結果與于海燕等[19]、白雪松等[20]、錢新華[21]等的結論相似。10個品種提取物ABTS自由基清除率的IC50值見表1。

圖7 不同品種萱草花醇提取物ABTS自由基清除率Fig. 7 ABTS free radical scavenging rate of alcohol extract from different varieties of Hemerocallis fulva flowers

2.5 萱草花多糖對DPPH自由基清除結果比較

如圖8所示，不同品種萱草花多糖DPPH自由基清除率隨著濃度的提高先增加而后趨于平緩。濃度在0～0.5 mg/mL范圍內時，DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度的增加而顯著增加；當濃度＞0.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率趨于平緩。濃度≈1 mg/mL時，‘星光玫瑰’和‘自由行’2個品種萱草花多糖提取物的DPPH自由基清除能力超過50%。‘烈焰’濃度≈2 mg/mL時，清除率超過50%。

圖8 不同品種萱草花多糖DPPH自由基清除率Fig. 8 DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides from different varieties of Hemerocallis fulva flowers

2.6 萱草花多糖對ABTS自由基清除結果比較

如圖9所示，0～1 mg/mL濃度范圍內，ABTS自由基的清除活性隨著萱草花多糖濃度的增加而增強，‘自由行’在此濃度下清除率達到最大；當濃度＞1 mg/mL時，大部分品種多糖提取物的ABTS自由基清除率仍有上升趨勢。當濃度≈2 mg/mL時，‘凝望’和‘茉莉百合’2個品種萱草花多糖提取物的ABTS自由基清除能力與VC相當，分別為96.25%和95.31%。10個品種提取物ABTS自由基清除率的IC50值見表2。

表2 不同品種萱草花多糖ABTS自由基清除率的IC50值Tab. 2 IC50 values of DPPH free radical and ABTS free radical scavenging rate of polysaccharides from different varieties of Hemerocallis fulva flowers

圖9 不同品種萱草花多糖ABTS自由基清除率Fig. 9 ABTS free radical scavenging rate of polysaccharides from different varieties of Hemerocallis fulva flowers

陸海勤等[17]研究發現，黃花菜粗多糖有一定的清除自由基的能力，且自由基清除活性與黃花菜粗多糖濃度呈正相關，當濃度=1.0 mg/mL時，黃花菜粗多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基及DPPH自由基的清除活性分別高達66.93%、70.61%和49.28%。本研究中，多糖濃度=1.0 mg/mL時，僅有‘星光玫瑰’（60.18%）、‘自由行’（52.80%）的DPPH自由基清除率超過50%；僅有‘自由行’=（87.48%）、‘牧羊人’（62.77%）、‘星光玫瑰’（57.93%）和‘烈焰’（54.26%）的ABTS自由基清除率超過50%，說明品種是影響抗氧化活性的重要因素之一。

本研究系統地比較了不同萱草品種中多酚、黃酮和多糖的含量及其抗氧化活性，但研究不夠深入，仍需做進一步的探索：①探究少溶劑或無溶劑的綠色提取方法制備萱草活性成分；②對萱草多糖、多酚和黃酮的種類和結構進行解析，評價其構效關系。

3 結語

本研究主要探究了不同品種的萱草花中黃酮、多酚和多糖含量及不同提取物的抗氧化活性之間的差異。研究結果表明：萱草花中多酚、黃酮及多糖含量存在明顯差異，醇提物（黃酮和多酚）和水提物（多糖）均顯示出較強的清除DPPH和ABTS自由基的能力，且在一定濃度范圍內呈劑量-效應關系。研究結果為萱草花各成分的綜合應用提供理論依據，并為萱草花的深度開發提供數據支撐。