野櫻莓果酒釀造工藝優化及抗氧化活性分析

汪娣，曾雪瑩，胡玉清，李楠

廣西大學生命科學與技術學院（南寧 530004）

野櫻莓（Aronia melanocarpa）又名不老莓、黑果腺肋花楸，是來源于北美洲東部濕樹林和加拿大東部的一種落葉灌木，屬于薔薇科類[1]。野櫻莓果實中含有許多對人體有益的物質，包括維生素、葉酸、奎寧酸、多酚酸、單寧、兒茶素、橙皮苷和花青素等[2]。同時野櫻莓果實含有豐富的黃酮類，也含有酚類中像花色苷一樣的化合物，使得野櫻莓具有較強的抗氧化活性，能夠清除多種氧自由基，在抗癌、抗炎、降血糖以及心腦血管等疾病方面具有良好的藥理作用[3-4]。甘蔗作為能量提供者，含有大量糖分，其中的鐵可以緩和人體缺鐵性的貧血[5]。與野櫻莓相似，甘蔗具有較強的抵抗突變、氧化和炎癥的能力，因為含有黃酮類、多酚類、單寧及多糖等多種具有生物活性的化合物，甘蔗也能降低人類患心腦血管疾病的概率，以此強身健體[6]。

近年來，具備保健功能的低醇度果酒越來越受到消費者的歡迎，研制此類果酒具有良好的市場前景。野櫻莓中含有豐富的生物活性成分，能與藍莓相媲美，具有釀造時間短一大特點，利用野櫻莓釀造出的果酒顏色透亮，營養豐富、口感醇厚、風味獨特。然而，對于野櫻莓的產品開發較少，缺乏系統研究，且野櫻莓中不含可發酵糖，甘蔗汁具有充分糖分和營養價值以增加果酒風味和特色。因此，試驗以野櫻莓為原料，利用甘蔗汁為發酵糖釀制果酒，整合雙方的營養功能，優化其發酵工藝條件，主要對果酒的抗氧化成分進行提取和研究，創新果酒類別，同時拓寬野櫻莓和甘蔗產業的應用范圍[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野櫻莓、白砂糖（市售）；釀酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；甘蔗（廣西農業科學院實驗基地提供）；果膠酶（50 000 U/g，南寧龐博生物技術有限公司）；偏重亞硫酸鉀（上海麥克林生化科技有限公司）；氫氧化鈉（天津博迪化工股份有限公司）；檸檬酸（南寧恒因生物科技有限公司）；DPPH（美國Sigma公司）；無水乙醇（成都市科隆化工試劑廠）；鐵氰化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；三氯化鐵（臺山市化工廠有限公司）；三氯乙酸（成都市科隆化工試劑廠）；磷酸二氫鈉（天津市大茂化學試劑廠）；磷酸氫二鈉（天津博迪化工股份有限公司）。所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JJ-2組織搗碎機（上海菁華科技儀器有限公司）；PAL-1日本愛拓迷你數顯折射計（廣州愛拓科學儀器有限公司）；PHS-3E雷磁pH計、TW-12恒溫水浴鍋（上海儀電科學儀器股份有限公司）；UVmini-1240紫外-可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]；SHP-250生化培養箱（優博萊技術有限公司）；PL-303電子分析天平（上海精宏實驗設備有限公司）；TGL-20M高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 野櫻莓果酒制備工藝與操作要點[9-11]

1.3.1.1 工藝流程

野櫻莓→挑選→去梗去枝→清洗→破碎→酶解→榨取甘蔗汁同時調整糖度、pH→主發酵→過濾→后發酵→澄清→陳釀→野櫻莓果酒

1.3.1.2 操作要點

原料的選?。哼x取形態飽滿、深紫色、無蟲蠅叮咬的野櫻莓；選取多汁新鮮且無蟲害的甘蔗；均儲存于-20 ℃冰箱備用。

預處理、破碎：野櫻莓和甘蔗清洗干凈，將甘蔗破碎榨汁儲存于-20 ℃冰箱備用，將野櫻莓去梗破碎打漿。

酶解：將野櫻莓和甘蔗汁按照7∶25（g/mL）的料水比混合，按質量比加入0.3%的果膠酶，在40 ℃條件下酶解3 h。

調整糖度、pH：添加白砂糖或蔗糖用來調整發酵液糖度至26.0 °Bx，用無水檸檬酸和堿性液體調整發酵液的pH至4.0。

主發酵：添加偏重亞硫酸鉀，使二氧化硫濃度30mg/kg進行殺菌；按照1 g/100 mL的接種量進行接種，攪拌均勻，封閉置于28 ℃的培養箱恒溫發酵9 d。

后發酵、澄清：將主發酵后的果酒濾液除渣，繼續將果酒密封處理，發酵完全，澄清得到初成品。

陳釀：果酒繼續密封保存可使果體更澄清，果味更醇厚。

1.3.2 野櫻莓果酒釀造單因素試驗設計

分別在野櫻莓添加量（16，20，24，28和32 g）、發酵溫度（24，26，28，30和32 ℃）、酵母接種量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%）條件下，對野櫻莓果酒的感官評分和酒精度等評價指標進行測定，確定最適宜的發酵條件。

1.3.3 野櫻莓果酒釀造正交試驗設計

在野櫻莓果酒釀造單因素試驗的基礎上，選擇發酵溫度（A）、野櫻莓添加量（B）和酵母添加量（C）為影響因素，以酒精度為評價指標，設計三因素三水平正交試驗，篩選野櫻莓果酒釀造的最適發酵條件[12]。設計正交試驗的因素與水平如表1所示。

表1 野櫻莓果酒發酵工藝優化正交試驗因素與水平

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 基本理化指標的測定

乙醇體積分數的測定按照GB/T 5009.48——2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的分析方法》；總酸含量測定均參照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酚采用Folin-Ciocalte比色方法[13]測定；還原糖含量采用3, 5-二硝基水楊酸法[14]測定；總黃酮采用硝酸鋁比色法[15]測定。

1.3.4.2 野櫻莓果酒抗氧化活性分析

測定野櫻莓果汁、野櫻莓果酒及0.3 g/L VC的DPPH自由基清除能力和總還原能力，探究其抗氧化活性。

DPPH自由基清除率的測定參考文獻[16-19]的方法，略有修改。分別準確移取0.6 mL不同體積分數（1%，2%，3%，4%，5%和6%）的樣品溶液，取5 mL 60 μmol/L的DPPH乙醇溶液加入其中，混勻，常溫避光30 min，在4 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清液，測定吸光度（波長517 nm）A1；將0.6 mL無水乙醇和5 mL DPPH乙醇溶液混勻，按上述方法測定吸光度A3；將5 mL無水乙醇和0.6 mL樣品水溶液混勻，按上述方法測定吸光度A2。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

總還原能力的測定參考文獻[20-22]的方法，略有改動。分別取1 mL不同體積分數樣液（5%，10%，15%，20%，25%和30%），加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液，混勻，加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液。于50 ℃反應20 min，迅速放入低溫冷卻，加入1 mL 10%三氯乙酸，終止反應，在4 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取2.5 mL上清液，按順序加入2.5mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，靜置5 min，測定吸光度（波長700 nm）。

1.3.5 感官評定

選擇有感官評定經驗的專家，男女共10名，組成野櫻桃果酒的感官評價小組。標準從色澤（20分）、氣味（30分）、滋味（40分）和典型性（10分）4個方面進行評定；參照GB/T 15038——2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》制定感官評分細則[23]，評分標準詳見表2，取百分制，最終評分結果為平均值。

表2 野櫻莓果酒感官評分標準

1.3.6 數據分析

使用Excel 2010整合試驗數據，平行3次試驗以保證數據客觀；使用SPSS 26.0軟件進行統計分析，使用Origin 2017制圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對野櫻莓果酒品質的影響

由圖1可見，隨著發酵溫度的增加，酒精度先趨于增加，后減少，在28 ℃時獲得最高的酒精度和感官評分。在24 ℃的發酵溫度下，成品野櫻莓果酒的酒精度為16.8%vol，感官評分為78.5分，此時果酒未發酵完全，果味濃郁，但是酒味略顯單薄，口味酸澀，主要原因可能是發酵溫度較低，微生物利用糖分產生較多的酸類物質，產生乙醇較少，同時此種情況下導致酵母活性較低，從而使得發酵速度較慢，果酒發酵不完全。發酵溫度升高至28 ℃時果酒酒精度達到最高，為17.4%vol，感官評分也居于最高，為87.4分，與孫天利等[24]發酵結果類似，結果表明此溫度下微生物繁殖迅速，發酵適中，酒香濃厚，但當溫度持續升高時，超過最適溫度會抑制微生物繁殖，導致發酵不充分，果酒異味增加，酒精度降低。因此，最適合野櫻莓果酒的發酵溫度為28 ℃。

圖1 發酵溫度對野櫻莓果酒品質的影響

2.1.2 野櫻莓添加量對果酒品質的影響

由圖2可知，在野櫻莓添加量28 g時，酒精度和感官評價達到最高。野櫻莓添加量16 g時，感官評分較低，為73.3分，口感風味較差。野櫻莓添加量持續增加到28 g時，酒精度到達峰值17.2%vol，感官評分也達到峰值89.2分。而隨著野櫻莓添加量繼續升高，果酒感官評分降低，與尚宏遠等[25]研究芒果蘋果復合果酒的結果一致。因此，最適合果酒的野櫻莓添加量為28 g。

圖2 野櫻莓添加量對野櫻莓果酒品質的影響

2.1.3 酵母添加量對果酒品質的影響

由圖3可知，野櫻莓果酒的酵母接種量1%時，酒精度達到峰值，感官評分適中。酵母接種量低于1%時，酵母活性低導致果酒不能充分發酵，因此果酒中的糖分不能被全部轉化，從而酒精度低。而酵母添加量持續增加時，酵母含量越高，酵母的轉化率變低，從而酒精度降低，感官評分降低[26]。因此，最適合野櫻莓果酒的酵母添加量為1%。

圖3 酵母添加量對野櫻莓果酒品質的影響

2.2 野櫻莓果酒釀造工藝優化正交試驗結果與分析

由表3可知，各個因素對野櫻莓果酒酒精度的影響主次順序依次為B＞C＞A，即野櫻莓添加量＞酵母添加量＞發酵溫度，其中野櫻莓添加量對野櫻莓果酒的發酵影響顯著，說明在發酵過程，野櫻莓添加量對酒精發酵品質影響最大，地位最重要。從k值大小可知，工藝的最佳組合為A2B3C2，即發酵溫度28 ℃、野櫻莓添加量28 g、酵母添加量1.0%，由于試驗沒有A2B3C2的組合，在最優條件下，進行3次試驗進行驗證，與謝春陽等[27]研究結果相似，發酵結束后的野櫻莓果酒酒精度為17.5%vol，感官評分為92.1分。

表3 野櫻莓果酒發酵條件優化正交試驗結果與分析

表4 誤差分析表

2.3 野櫻莓果酒成品檢測結果及分析

野櫻莓果酒澄清透明，顏色淺紫色有光澤，無懸浮物及沉淀；有明顯的野櫻莓果香，酒香自然；酸甜協調，柔和爽口，風格明顯。理化和微生物指標檢測結果見表5。按最優工藝條件發酵的野櫻莓果酒的理化指標及微生物量均符合GB 2758——2012《發酵酒及其配制酒》[28]。

表5 野櫻莓果酒理化及微生物指標檢測結果

2.4 野櫻莓果酒抗氧化能力

野櫻莓果酒、野櫻莓果汁及0.3 g/L VC對DPPH自由基的清除能力和總還原能力的測定結果見圖4。

圖4 不同樣品清除DPPH自由基（A）及總還原能力（B）的能力

由圖4（A）可知，野櫻莓果酒、野櫻莓果汁及0.3 g/L VC對DPPH自由基的清除作用均隨著濃度的增加而增強，但增長的速率有所不同，具有良好線性關系。體積分數6%時，不同樣品DPPH自由基清除率排序為野櫻莓果酒（91.76%）＞野櫻莓果汁（64.85%）＞0.3 g/L VC（8.51%），野櫻莓果酒清除率最高，抗氧化能力明顯比野櫻莓果汁好，說明相比較自然果汁，發酵可使活性成分更好地發揮作用并溶出，表明野櫻莓果酒可有效清除DPPH自由基。

由圖4（B）可知，野櫻莓果酒、野櫻莓果汁及0.3 g/L VC的還原能力隨樣品用量的增加三者均呈現上升趨勢。在試驗范圍內，2種樣品的還原能力均優于0.3 g/L VC，且樣品體積30%時，野櫻莓果汁還原能力是0.3 g/L VC的44.45%，野櫻莓果酒還原能力與0.3 g/L VC相當。這說明野櫻莓果酒具有良好的還原能力。

3 結論與討論

運用單因素試驗，在結合正交試驗設計的基礎上分析得出野櫻莓果酒釀造的最優工藝參數：野櫻莓添加量28 g、發酵溫度28 ℃、酵母添加量1%。此條件下得到的果酒酒精度為17.5%vol，果酒顏色澄清透明、酒香濃郁、入口微酸，感官評分為92.1分，各項理化及微生物指標均符合食品安全國家標準。野櫻莓成品果酒富含黃酮，對比其他2類樣品的DPPH自由基清除能力和總還原能力，均反映果酒具有較好的抗氧化活性。試驗為野櫻莓的應用開闊了前景，也為利用甘蔗汁的發酵增加新思路。