紫莧籽粒乙醇提取工藝及其抗氧化性研究

王宇婷，金鐵巖，王云峰，王龍宇，張智勇，熊思睿

延邊大學農學院（延吉 133002）

假谷物也稱為準谷物，并不是真正意義上的谷物，但與谷物有相同的營養成分及功能。假谷物中存在高質量的淀粉、膳食纖維、蛋白質，豐富的礦物質、維生素及其他的生物活性物質，可以為人體提供營養和能量，是重要的能源物質之一[1]。

紫莧籽粒（purple amaranth grain）是一種新型的糧食作物資源，被人們稱為假谷物，并不是真正的谷物產品，它的成分和用途與小麥、大米等谷物相似，且不包含麩質[2]，目前作為優質的食品原料摻入谷物食品中[3]。紫莧籽粒中含有豐富的優質蛋白質、淀粉、脂肪、維生素、礦物質，膳食纖維及不飽和脂肪酸等其他生物活性，例如多酚[4]。紫莧籽粒粉中豐富的蛋白質、礦物質、維生素以及微量元素可以有效預防慢性疾病的發生。因此它的使用價值和營養價值較高。同時具有顯著的降血壓、降血脂、延緩衰老、預防慢性疾病的作用[5]，因此紫莧籽粒粉的保健功效和藥用價值較高。而且有大量的研究證明，植物中多酚具有一定的抗氧化能力[6]。因此植物中的多酚被添加到保健食品中，充分發揮了紫莧籽粒的食用價值和藥用價值[7]，進而生產出營養健康的食品，對此可以進行更深度的研究。

試驗對乙醇提取紫莧籽粒中的多酚含量進行測定，得出最優提取的多酚含量，并對紫莧籽粒乙醇提取物（AEE）的抗氧化活性進行測定。研究表明紫莧籽粒多酚類物質的抗氧化性能力，可提升紫莧籽粒的利用價值，為開拓紫莧籽粒市場提供了理論數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫莧籽粒粉末（延邊悟德醬酒有限公司）；體積分數為95%的乙醇（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；沒食子酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH標準品（色譜純，上海華藍化學科技有限公司）；抗壞血酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；ABTS標準品（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；碳酸鈉、氯化鐵、鐵氰化鉀、福林酚、三氯乙酸、過硫酸鉀、鹽酸溶液、磷酸鹽緩沖液（均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設備

YP2002分析天平（上海科教儀器有限公司）；GC-MS-QP2010電子天平（上海英展機電企業有限公司）；U-3900紫外分光光度計（日立天美公司）；Y-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-IIIA型真空泵（上海豫康科教儀器設備有限公司）；FD=1C-50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；101B電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 紫莧籽粒多酚含量的測定

測定多酚含量的原理是Folin-Ciocalteu試劑中多酚發生的還原反應。參考滿朝坤[8]的方法檢測多酚含量，并繪制沒食子酸標準曲線：精密稱取0.010 0 g沒食子酸標準品置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解搖勻后定容至刻度線，獲得0.10 mg/mL的沒食子酸標準品溶液，分別準確移取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL標準品溶液置于棕色容量瓶中，加蒸餾水至總體積6.0 mL，后加入0.5 mL福林試劑并攪拌均勻，在0.5～8 min內加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，充分攪拌，定容，在30 ℃條件下避光0.5 h，取6.0 mL無標準溶液蒸餾水作為空對照，在波長750 nm處測量吸光度，并平行測量每個樣品3次。

1.2.2 紫莧籽粒提取物制備

紫莧籽粒粉過0.180 mm篩，放在-20 ℃的冰箱中儲存備用。

將紫莧籽粒粉末與不同體積分數乙醇以不同比例混合，在25 ℃的條件下浸泡1～24 h后進行過濾，取上清液進行抽濾。得到的乙醇提取液利用旋轉蒸發儀在減壓下蒸發出乙醇和多余的水分，最后得到紫莧籽粒粉末提取物浸膏。將該浸膏放在-70 ℃的冰箱內冷凍后放在真空冷凍干燥機中儲存，凍干后變成粉末，稱重并密封儲存備用[9]。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 乙醇體積分數對多酚提取含量的影響

準確稱取6 g紫莧籽粒粉，分別用體積分數為50%，60%，70%，80%和90%的乙醇提取劑，料液比按1∶30（g/mL）混合，浸泡24 h后，得到上清液并采用福林酚法測定得到溶液中的多酚物質含量。

1.2.3.2 料液比對多酚提取含量的影響

準確稱取6 g紫莧籽粒粉，使用體積分數為80%的乙醇為提取劑，分別按照料液比1∶5，1∶10，1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）混合，浸泡24 h后得到上清液并采用福林酚法測定得到溶液中的多酚物質含量。

1.2.3.3 提取時間對多酚提取含量的影響

準確稱取6 g紫莧籽粒粉，使用體積分數為80%的乙醇為提取劑，料液比按1∶30（g/mL）混合，分別浸泡1，3，6，12和24 h后得到上清液并采用福林酚法測定得到溶液中的多酚物質含量。

1.2.4 正交試驗

通過試驗結果分析乙醇提取紫莧籽粒中多酚含量，其單因素的最優條件為料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分數80%、浸泡時間12 h，設計的正交試驗因素水平如表1所示。

表1 試驗因素水平表

1.2.5 DPPH自由基清除率測定

DPPH又稱1, 1二苯基-2-三硝基苯肼，它是一種極其穩定的氮中心自由基[10]。測定植物提取物的抗氧化能力一般選擇DPPH自由基作為衡量指標。DPPH的特征吸收峰位于517 nm附近。利用試驗檢測不同的吸光度對清除自由基能力進行評價[11]，該方法是研究體外自由基清除能力中用到最多的方法，此方法便捷，高效[12-13]。

將4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液分別與不同濃度的紫莧籽粒多酚提取液放置在試管中充分混勻，室溫下避光約0.5 h，以無水乙醇與水體積比1∶1作為空白試驗。

將維生素C（抗壞血酸）作為對照，處理方法同上，測定后計算紫莧籽粒多酚提取物對DPPH自由基清除率（%），按式（1）計算。

式中：A0為測定樣品溶液在517 nm處的吸光度；A1為紫莧籽粒提取物和無水乙醇溶液（1∶1）混合后的吸光度；A2為DPPH溶液和無水乙醇混合后的吸光度。

1.2.6 ABTS自由基清除率測定

ABTS的特征吸收峰位于734 nm附近。通過檢測吸收，從而評估ABTS自由基清除能力[14-15]。

制備ABTS工作液：準確稱取4 mg過硫酸鉀和12mg ABTS，配制出7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液。將配制完成的ABTS溶液與過硫酸鉀溶液按1∶1混合，室溫下避光放置12～16 h，再用無水乙醇將混合溶液稀釋約50倍，確保其在734 nm處吸光度為0.7±0.02。分別提取4 mL不同濃度的紫莧籽粒提取液于試管，再加入16 mL ABTS工作液，混勻后靜置6 min，檢測其在734 nm處吸光度A0，將蒸餾水作為空白對照，檢測其吸光度A1。

將維生素C（抗壞血酸）作為對照，處理方法同上，檢測后計算紫莧籽粒多酚提取物對ABTS自由基清除率（%），按式（2）計算。

式中：A1為ABTS工作液與蒸餾水混合后測得的吸光度；A0為紫莧籽粒提取物液與ABTS工作液混合后測得的吸光度。

1.2.7 Fe3+還原能力測定

把不同濃度的AEE移入試管，取5 mL在50 ℃下冷卻0.5 h后取出。然后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心15 min。取5 mL懸液，依次加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%氯化鐵溶液，攪拌均勻，反應約9 min后在700 nm處測量吸光度[16]。以抗壞血酸（VC）作為參照，操作方法同上。

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對多酚含量的影響

根據圖1可知，在只改變乙醇體積分數的條件下，用體積分數為80%的乙醇提取時得到的多酚含量最多（10.684 mg/g）。因此得出乙醇體積分數為80%時得到的多酚含量最優。

圖1 乙醇體積分數對多酚提取含量的影響

2.2 料液比對多酚含量的影響

根據圖2可知，在只改變料液比的條件下，在料液比為1∶30（g/mL）時提取得到的多酚含量最多（10.873 mg/g）。因此得出料液比1∶30（g/mL）時得到的多酚含量最優。

圖2 料液比對多酚含量的影響

2.3 提取時間對多酚含量的影響

根據圖3可知，在只改變提取時間的條件下，在提取時間為12 h得到的多酚含量最多（10.914 mg/g）。因此得出提取時間在12 h得到的多酚含量最優。

圖3 提取時間對多酚含量的影響

2.4 正交試驗結果

根據表2和表3分析得出，相對明顯的影響因素有乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C），以上三個因素對紫莧籽粒乙醇提取多酚最優的理論方案是A2B3C3；而正交試驗結果的最優方案是A2B2C3，原因是正交試驗因素水平較少造成的偏差。所以理論最優水平A2B3C3為最終的最優方案，即用配制好體積分數為80%的乙醇溶液浸泡，料液比1∶33（g/mL），提取時間12 h，在以上因素下稱取6 g紫莧籽粒粉末進行試驗，得到的多酚含量為10.914 mg/g，得到的結果比正交試驗得好。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

2.5 紫莧籽粒提取物的DPPH自由基清除能力

如圖4所示，DPPH屬于強抗氧化劑[17]，如果維生素C的質量濃度為0.5 mg/mL，會被完全還原呈透明色。因此，在此濃度水平下AEE的自由基清除率為25%～38%。多酚提取物消除自由基的能力與劑量呈成正相關，即多酚提取物濃度越高，DPPH自由基消除能力越強，由此可見紫莧籽粒提取物的濃度與其抗氧化活性直接相關，該結果與之前的研究一致[18]。Shah等[19]也研究發現多酚類化合物可以作為質子供體發揮功能。所以，紫莧籽粒提取物中的化合物可能也存在相似作用。當其質量濃度為3 mg/mL時，AEE的自由基清除能力為75.43%。與陽性對照抗壞血酸相比，抗壞血酸對DPE的去除率顯著低于對照組（P＞0.05）。如果其質量濃度超過3 mg/mL時，紫莧籽粒提取物的DPPH自由基清除率上升幅度較小。因此，利用乙醇提取能夠獲得活性更優的提取物，可以用于制作抗氧化劑。

圖4 紫莧籽粒提取物的DPPH自由基清除能力

2.6 紫莧籽粒提取物ABTS自由基清除能力

如圖5所示，AEE對ABTS自由基的清除能力較高。如果提取物的質量濃度低于2.5 mg/mL，AEE的清除能力在17.53%～58.94%之間。當質量濃度為3.5 mg/mL時，AEE對ABTS的去除率最高為61.02%，但顯著低于VC。與DPPH自由基清除能力對比，AEE對ABTS自由基的清除能力不足。參考其他研究人員的結論，也證實了假谷物與普通谷物的ABTS自由基的清除能力都不算良好的結論[20]。

圖5 紫莧籽粒提取物的ABTS自由基清除能力

2.7 紫莧籽粒提取物的鐵離子還原能力

如圖6所示，紫莧籽粒提取物和維生素C的鐵離子還原性與其濃度呈正比，濃度升高則還原能力增強，但是紫莧籽粒提取物的還原能力不如維生素C。如果紫莧籽粒提取物的質量濃度達到4 mg/mL，AEE的吸光度是2.156，由此可見AEE具備鐵離子還原能力。

圖6 紫莧籽粒提取物的鐵離子還原能力

3 結論

紫莧籽粒提取物多酚含量比紫莧籽粒原料多，其原因可能是乙醇溶劑為物質發散提供液體環境并促進化合物或離子締合[21]。紫莧籽粒在用乙醇體積分數80%、料液比1∶33（g/mL）、提取時間12 h的條件下含量最優。紫莧籽粒提取物對DPPH自由基、ABTS自由基和鐵離子都有良好的自由基清除能力。其中紫莧籽粒乙醇提取物（AEE）的DPPH自由基清除能力最優。提取物的濃度越高，抗氧化活性和還原能力也隨之上升。但是與相同濃度的維生素C溶液相比，AEE的抗氧化活性不高。

總之，由于紫莧籽粒提取物中有一定濃度的多酚，而多酚在自由基捕獲和還原能力方面有所差異，追根溯源，紫莧籽粒提取物中多酚分子的酚羥基發揮協同作用從而發生對自由基清除能力的抑制是其主要原因[22]。有關分析顯示，紫莧籽粒提取物的自由基清除和還原功能有所差異，這與提取物中的多酚有關，因此可研發以青紫莧籽粒為主要原料的保健食品。