酸奶、液態奶三聚氰胺基質效應的研究及消除

景贊，呂雪梅，劉超

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺（melamine）俗稱密胺、蛋白精、蜜胺，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物[1]，常用作化工原料。因其對人體有害，故不可用于食品加工或作為食品添加劑。

基質效應是指檢測系統檢測樣品中的分析物時，處于分析物周圍的所有非分析物質對分析物參與反應的影響。基質效應產生的原因與4個主要因素的相互作用密切相關，即儀器的設計、試劑的組成成分、測試方法的原理、質控材料的組成及處理技術。液相色譜-質譜聯用技術是將分離性能優異液相色譜串聯專屬、能提供相對分子量和結構信息的質譜法的一種快速、靈敏、準確的現代分離分析技術，而且被廣泛用于定量分析復雜基質中的物質[2-4]。串聯質譜特異性強，同時數據表明質譜的檢測需要避免基質效應[5-9]，否則會影響其檢測準確性。

試驗采取內標法[10-12]消除三聚氰胺的基質效應，內標法是一種間接或相對的校準方法。在測定樣品中三聚氰胺含量時，加入三聚氰胺內標物質以校準和消除基質效應對分析結果產生的影響，以提高分析結果的準確度。

試驗引入單因素方差分析及基質效應的評價方法具體量化液質聯用檢測酸奶、液態奶中三聚氰胺基質效應大小，為研究和消除因檢測過程引起的基質效應提供量化指標。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質聯用儀（美國AB SCIEX公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創科技有限公司）；VM24固相萃取儀（天津艾杰爾科技有限公司）；HT190R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（長州冠軍儀器制造頭有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]、Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL天津艾杰爾科技有限公司）、Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；液態奶（金典、特侖蘇、伊利純牛奶、蒙牛純牛奶、三元純牛奶、光明乳業、旺仔、新希望、圣牧、QQ星）和酸奶（安慕希、純甄、莫斯利安、君樂寶、光明乳業、德亞、冠益乳、新希望初心、簡愛、人養一頭牛），均購于超市；三聚氰胺標準品（99.4%，批號G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL，壇墨質檢科技股份有限公司）。

1.3 樣品處理

采用GB/T 22388——2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》“4.4.1.1”提取、“4.4.2”凈化。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標準及內標中間液

1.5.1 三聚氰胺標準中間液

準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5.2 三聚氰胺內標中間液

準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質譜/質譜條件

液相色譜及質譜條件參照GB/T 22388——2008。

1.7 基質效應評價方法

運用定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應程度，通過式（1）計算二者比值評價基質效應。

式中：A和B為基質溶液和純溶劑分析物的峰面積。A/B＜80%，對分析物的響應產生抑制作用；A/B＞120%，對分析物的響應產生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質效應。

1.8 統計分析

所有數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 取樣量對基質效應的影響

10種液態奶和10種酸奶每個樣品分別取樣品0.50 g和1.00 g（精確至0.01 g）按照1.3樣品處理，按照1.6測定并記錄峰面積。結果見表1，圖1和圖2。

圖1 取樣量對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖2 取樣量對液態奶三聚氰胺ME的影響

表1 取樣量對三聚氰胺ME的影響

表1為取樣量對酸奶、液態奶中分析三聚氰胺ME的統計分析結果。結合圖1和圖2可知，取樣量對分析酸奶、液態奶中三聚氰胺ME存在顯著性差異。因此取樣量是影響液態奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖1進一步可以得出，取樣量0.50 g和1.00 g對酸奶中三聚氰胺的ME分別為21.4%～32.5%和10.3%～23.1%。由圖2進一步可以得出，取樣量0.50和1.00 g對液態奶中三聚氰胺的ME分別為23.6%～39.0%和14.7%～27.4%。

2.2 溶劑種類對基質效應的影響

10種液態奶和10種酸奶每個樣品分別取4份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每種液態奶和酸奶的每份樣品依次加入10 mL水、6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水、10 mL三氯乙酸（1%）、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈，每個樣品超聲提取10 min后，按照1.3處理，按照1.6測定并記錄數據。結果見表2，圖3和圖4。

圖3 不同溶劑對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖4 不同溶劑對液態奶三聚氰胺ME的影響

表2 溶劑種類對ME的影響

表2為不同溶劑對酸奶、液態奶中三聚氰胺ME的統計分析結果。結合圖3和圖4可知，溶劑種類對分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈體積比4∶1之間無顯著性差異，其余均有顯著差異。因此溶劑種類是影響液態奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖3進一步可以得出，水、乙腈-水體積比3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈體積比4∶1對酸奶中三聚氰胺的ME分別為25.9%～36.7%，19.0%～31.3%，6.5%～19.0%及10.0%～22.7%溶劑。由圖4進一步可以得出，乙腈∶水=3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸∶乙腈=4∶1對液態奶中三聚氰胺的ME分別為34.8%～46.7%、25.5%～37.6%、12.7%～25.9%及14.3%～27.3%溶劑。提取溶劑種類對分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸∶乙腈= 4∶1無顯著性差異。其余均有顯著差異。

2.3 溶劑用量對基質效應的影響

10種液態奶和10種酸奶每個樣品分別取3份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每份樣分別加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈、12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。剩余按照1.3處理，按照1.6測定并記錄數據。

表3為溶劑用量對酸奶、液態奶中三聚氰胺ME的統計分析結果。結合圖5和圖6可知，溶劑用量對分析液態奶、酸奶中三聚氰胺ME除10 mL與15 mL無顯著性差異，其余均存在顯著性差異。因此取樣量是影響液態奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖5進一步可以得出，溶劑用量為5，10和15 mL對液態奶中三聚氰胺的ME分別為21.5%～34.3%，10.8%～23.7%和7.5%～20.4%。由圖6進一步可以得出，溶劑用量為5，10和15 mL對液態奶中三聚氰胺的ME分別為28.8%～41.9%，14.2%～27.5%和11.6%～24.7%。

圖5 溶劑用量對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖6 溶劑用量對液態奶三聚氰胺ME的影響

表3 溶劑用量對ME的影響

2.4 不同濃度三聚氰胺對基質效應的影響

分別取10種液態奶和10種酸奶各3份樣品1.00 g（精確至0.01 g），每種液態奶的每份樣品分別編號為1號（液態奶、酸奶名稱），2號（液態奶、酸奶名稱）和3號（液態奶、酸奶名稱）。按照1.3處理。處理后取0.1 μL三聚氰胺標準儲備液加入1號（液態奶、酸奶名稱）搖勻；取0.5 μL三聚氰胺標準儲備液加入2號（液態奶、酸奶名稱）搖勻；取1.0 μL三聚氰胺標準儲備液加入3號（液態奶、酸奶名稱）搖勻。按照1.6測定并記錄數據。

表4為不同濃度三聚氰胺對酸奶、液態奶中三聚氰胺ME的統計分析結果。結合表4，圖7和圖8可知，不同濃度三聚氰胺對分析液態奶、酸奶中三聚氰胺ME不存在顯著性差異。由圖7進一步可以得出，10，50和100 ng/mL不同濃度三聚氰胺對酸奶中三聚氰胺的ME分別為12.5%～25.0%，14.6%～23.6%和12.2%～20.4%。由圖8進一步可以得出，0，50和100 ng/mL不同濃度三聚氰胺1對液態奶中三聚氰胺的ME分別為14.2%～27.1%，15.5%～26.6%和15.0%～27.5%。

圖7 不同濃度三聚氰胺對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖8 不同濃度三聚氰胺對液態奶三聚氰胺ME的影響

表4 不同濃度三聚氰胺對ME的影響

2.5 SPE小柱對基質效應的影響

分別取10種液態奶和10種酸奶各4份平行樣品1.00 g（精確至0.01 g），每份樣品過前處理小柱時分別為待凈化液不過柱、待凈化液過WCX前處理小柱、待凈化液過Cleanert PCX前處理小柱、待凈化液過Bond Elut Plexa PCX前處理小柱。按照1.6測定并記錄數據。

表5為SPE小柱對酸奶、液態奶中三聚氰胺ME的統計分析結果。結合表5與圖9、圖10可知不過住與過SPE小柱之間存在顯著性差異；過SPE小柱之間不存在顯著性差異。由圖9進一步可以得出SPE小柱類型：不過柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對酸奶中三聚氰胺的ME，分別為4.3%～20.7%、10.4%～23.3%、9.9%～22.7%和9.9%～23.1%。由圖9進一步可以得出SPE小柱類型中，不過柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對液態奶中三聚氰胺的ME分別為9.3%～22.2%、14.7%～27.6%、14.3%～27.0%和14.3%～27.4%。

圖9 SPE小柱對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖10 SPE小柱對液態奶三聚氰胺ME的影響

表5 SPE小柱對液態奶、酸奶三聚氰胺ME的影響

表6 三聚氰胺線性方程

2.6 基質效應的消除

繪制標準曲線。分別移取不同體積的三聚氰胺中間液及相同體積的三聚氰胺標準中間液至6個25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到質量濃度依次為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺內標濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標作圖，三聚氰胺峰面積/內標峰面積為縱坐標得標準曲線回歸方程。

稱量9份空白樣品至9個50 mL離心管中，加入20 μL內標中間溶液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺標準中間溶液，做三水平三平行回收試驗，其余步驟按1.3。

將加標三聚氰胺峰面積/內標峰面積代入，得到三聚氰胺線性的回歸方程y=0.634x+0.185 2，得出計算濃度，數據如表7和表8。

表7 酸奶樣品三聚氰胺回收率

表8 液態奶樣品三聚氰胺回收率

從表7與表8可知酸奶、液態奶在低、中、高3個水平均很大程度上降低基質效應，回收率在100%～110%之間。因此內標法對三聚氰胺ME的消除具有顯著效果。

3 結論

從取樣量、溶劑種類、溶劑用量、不同濃度三聚氰胺和SPE小柱這5個因素研究對液態奶、酸奶中三聚氰胺的基質效應。結果表明，對液態奶、酸奶三聚氰胺基質效應的影響相差較為明顯。可能是不同公司對液態奶、酸奶的配方不同、制作工藝不同、采用的配方及牛奶原料種類不同，因此液態奶、酸奶中三聚氰胺的基質效應起伏變化比較明顯。單因素方差分析表明：取樣量對分析的ME差異顯著，提取溶劑種類對分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈體積比4∶1之間沒有顯著性差異，不存在基質效應；提取溶劑用量10 mL與15 mL之間差不存基質效應；不同濃度三聚氰胺不存在基質效應；過SPE小柱之間不存在基質效應；其余因素均存在明顯基質效應。