黃芪豆豉對(duì)氣虛血瘀型大鼠血液流變學(xué)的影響

王萍，陳麗艷，孫銀玲，蒙艷麗，王欣，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院（哈爾濱 150036）

氣虛血瘀是諸如冠心病、肺心病、高血壓病、糖尿病、腦卒中、缺血性中風(fēng)等多種疾病的重要病理基礎(chǔ)，是疾病進(jìn)展的某個(gè)階段癥狀綜合性的表現(xiàn)，也是老年認(rèn)知功能障礙的主要病機(jī)之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，氣虛血瘀證患者血液流變學(xué)呈黏聚傾向，微循環(huán)障礙，凝血功能亢進(jìn)，纖溶活性降低等[1-5]。《醫(yī)林改錯(cuò)》中記載的補(bǔ)陽還五湯為針對(duì)氣虛血瘀證的主要益氣活血方劑，以黃芪為君補(bǔ)氣且能固攝經(jīng)絡(luò)之氣，當(dāng)歸為臣，佐以赤芍，川芎，桃仁，紅花活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)。而黃芪具有補(bǔ)氣升陽、托毒排膿、斂瘡生肌、利水消腫、固表止汗的功效，與大豆共發(fā)酵提高了纖溶酶活性，同時(shí)又兼具黃芪的補(bǔ)氣作用，共同增強(qiáng)并發(fā)揮“益氣活血”作用[1,6-8]。因此，此次試驗(yàn)通過研究黃芪豆豉對(duì)氣虛血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)的影響，探討其益氣活血作用及其機(jī)制，為黃芪豆豉的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部），70只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，許可證號(hào)：SCXK（黑）2019-001。

1.2 試驗(yàn)藥物

采用前期課題組研究黃芪豆豉發(fā)酵的最優(yōu)工藝，稱取黃芪，加10倍量的水煎煮2次，每次1 h，合并濾液，制成的黃芪提取液質(zhì)量濃度為75 mg/mL（依據(jù)藥典用量），以75 mg/mL的黃芪提取液按照1∶1（mL/g）浸泡大豆，待大豆吸盡溶液，裝袋，于121 ℃滅菌40 min，接種DCT-1菌液[9]（108CFU/mL，2%），于37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h制備黃芪豆豉，備用，其中黃芪豆豉和豆豉組因考慮酶活性加入生理鹽水利用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿；補(bǔ)陽還五湯經(jīng)過煎煮濃縮后均制備成2 g/mL生藥量的母液保存，備用，用時(shí)用生理鹽水配制成所需濃度[10-11]。

1.3 儀器

DL-CJ-2N凈化工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司）；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技儀器有限公司）；Tecan infinite M200 PRO Nano Quant多功能酶標(biāo)儀[帝肯（上海）貿(mào)易有限公司]；Legend micro 17R冷凍高速離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；GEN Ⅲ MicroStation自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（美國 BIOLOG公司）；LBY-N6B型血液黏度儀（北京普利生儀器有限公司）；LBY-BX型紅細(xì)胞變形儀（北京普利生儀器有限公司）；LBY-NJ型血小板聚集儀（北京普利生儀器有限公司）。

1.4 試劑

血栓素（TXB2，上海生工生物股份有限公司，批號(hào)：20190823）；6-酮-前列腺素PGF1α（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190820）；氯化鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190108）；DCT-1菌株（前期課題組分離自淡豆豉飲片）；黃豆（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017年種植采收）；黃芪{亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membrannceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）]}；Hsiao的干燥根、補(bǔ)陽還五湯（購自黑龍江哈爾濱海輝連鎖藥店）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型構(gòu)建及給藥方法

在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，復(fù)合因素誘導(dǎo)氣虛血瘀動(dòng)物模型比較多樣。王賢成等[12]采用“力竭游泳+皮下注射腎上腺素”復(fù)制氣虛血瘀大鼠模型；龐樹玲等[13]采用“饑餓+寒涼+疲勞游泳”復(fù)制氣虛血瘀大鼠模型；胡建鵬等[14]采用“饑餓+勞累+高脂飲食+結(jié)扎左側(cè)總動(dòng)脈”復(fù)制大鼠缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證模型。此研究采用“饑餓+寒涼+力竭游泳”方法建立氣虛血瘀大鼠模型，具有造模方法穩(wěn)定、與臨床病癥結(jié)合度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

大鼠常規(guī)喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只，分為空白組、模型組、黃芪豆豉高劑量組（6 g/kg）、黃芪豆豉中劑量組（3 g/kg）、黃芪豆豉低劑量組（1.5 g/kg）、豆豉組及補(bǔ)陽還五湯組（陽對(duì)藥組）。

空白組：采用常規(guī)飼養(yǎng)，充足食水。

造模組及各給藥組：試驗(yàn)過程中各組每天進(jìn)行力竭游泳試驗(yàn)，將大鼠置于水深35±5 cm，水溫15±2℃，直徑90 cm的水桶中進(jìn)行游泳，以每組大鼠自然沉降沒入水中3～5 s不能自主上浮為其疲憊標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)全組有50%出現(xiàn)自然沉降時(shí)，全組停止游泳撈出，使之暴露于空氣中自然晾干，連續(xù)造模60 d。每日力竭游泳后各組給予正常飲食量的1/2飼養(yǎng)，每天每只大鼠按照40 g/kg喂養(yǎng)。

此研究采用造模與給藥同時(shí)進(jìn)行的方式，給藥組采用灌胃給藥，空白組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)造模給藥60 d。

2.2 血液流變學(xué)指標(biāo)及相關(guān)因子分析

2.2.1 血清樣品的處理方法

造模給藥60 d后，從各組大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1 h，按3 000 r/min離心10 min，仔細(xì)收集上清，保存于-20 ℃冰箱中備用。

2.2.2 血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測[5,15]

取4 mL肝素鈉抗凝血，采用全自動(dòng)血液流變儀，設(shè)置為高、中和低三個(gè)切變率，進(jìn)行全血黏度測定。

取2 mL枸櫞酸鈉抗凝血，在3 000 r/min高速離心10 min，取上層血漿，進(jìn)行血漿黏度測定，儀器同上。

取2 mL EDTA-K2抗凝血，進(jìn)行紅細(xì)胞聚集指數(shù)測定，儀器同上。

采用酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）測定大鼠血清中血栓素B2和6-酮前列腺素PGF1α（6-keto-PGF1α）的含量[16]。按照試劑盒所提供說明書進(jìn)行操作及檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及對(duì)應(yīng)的吸光度（A）計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的吸光度（A）計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 血流變學(xué)指標(biāo)

由表1，表2及圖1～圖4可得：與空白組相比，模型組的全血低、中、高切差異極顯著（**P＜0.01），全血相對(duì)指數(shù)低切、高切差異極顯著（**P＜0.01），說明模型組造模很成功；與模型組相比，空白組的全血高、中、低切，黃芪豆豉低劑量組的低切、高切，黃芪豆豉中劑量組的低切、高切，黃芪豆豉高劑量組的低切、高切差異極顯著（##P＜0.01）；空白組、黃芪豆豉低劑量組和中劑量組的全血相對(duì)指數(shù)低切、高切及黃芪豆豉高劑量組的低切差異極顯著（##P＜0.01）；而血漿黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），表明黃芪豆豉可以降低氣虛血瘀模型大鼠全血黏度，緩解“黏”“稠”的特征，從而改善血瘀證，體現(xiàn)出活血作用。

圖1 大鼠全血黏度柱狀圖

圖2 大鼠全血相對(duì)指數(shù)柱狀圖

圖3 大鼠全血相對(duì)指數(shù)柱狀圖

圖4 大鼠全血相對(duì)指數(shù)柱狀圖

表1 各組大鼠全血黏度指標(biāo)

表2 各組大鼠全血相對(duì)指數(shù)和紅細(xì)胞聚集指數(shù)的影響

3.2 大鼠全血相對(duì)指數(shù)和紅細(xì)胞聚集指數(shù)

3.3 各組大鼠血液中血栓素B2/6-酮前列腺素-PGF1α對(duì)比分析

結(jié)果如圖5～圖7所示，模型組大鼠血栓素B2含量為12.89 ng/L，6-酮前列腺素-PGF1α含量為1 302.75 ng/L，血栓素B2和6-酮前列腺素-PGF1α的比值為0.009 9，黃芪豆豉高、中、低劑量組大鼠血栓素B2含量分別為7.29，6.04和8.83 ng/L，6-酮前列腺素-PGF1α含量分別為2 079.51，2 039.93和1 880.74 ng/L，血栓素B2和6-酮前列腺素-PGF1α的比值分別為0.003 5，0.002 9和0.004 6，可見黃芪豆豉高、中、低劑量組TXB2/6-keto-PGF1α濃度相對(duì)于模型組明顯減低并趨近于空白組，其中黃芪豆豉中劑量組最接近空白組水平，表明適當(dāng)劑量的黃芪豆豉能降低血小板聚集性和血液黏度，從而減輕“血瘀證”，具有活血作用。

圖5 各組大鼠血液中TXB2的含量

圖6 各組大鼠血液中6-keto-PGF1α的含量

圖7 各組大鼠血液中TXB2/6-keto-PGF1α的比值

4 討論與結(jié)論

以氣虛血瘀的中醫(yī)指導(dǎo)理論為基礎(chǔ)，通過對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物采用冷水力竭游泳+限食飼養(yǎng)饑餓+力竭疲勞游泳的復(fù)合因素方法成功復(fù)制氣虛血瘀大鼠模型。造模方法和指標(biāo)檢測均比較符合氣虛血瘀癥狀，模型組大鼠因長期力竭和饑餓的條件下，氣血不足，身體調(diào)養(yǎng)欠缺，使其體重增長緩慢，毛發(fā)凌亂無光澤，耳部、爪部及尾部發(fā)白無血色，精神萎靡。從證型角度造模更符合中醫(yī)理論，較化學(xué)藥物造模更適用于中藥的藥理學(xué)研究。

對(duì)氣虛血瘀證模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測有重要的意義，全血黏度表示血液總體（包含血細(xì)胞和血漿）流動(dòng)性的指標(biāo)。全血黏度增高表示血液黏滯性增加而流動(dòng)性降低。由于血液在不同的流動(dòng)狀態(tài)（切變速度）下所表現(xiàn)的黏度是不同的，因而一般測定由高到低幾種不同切變速度下的全血黏度，用以大致反映血液在體內(nèi)不同粗細(xì)、不同壓差的血管中的流動(dòng)性。血漿黏度增加的直接原因是血漿纖維蛋白原或大分子球蛋白增加，或血脂顯著增加。全血相對(duì)指數(shù)是指除去血漿黏度這個(gè)影響因素后的全血黏度，它反映血細(xì)胞濃度和血細(xì)胞本身性質(zhì)對(duì)血液流動(dòng)性的影響，它也有兩個(gè)指標(biāo)：（1）全血高切相對(duì)黏度，其增加的直接原因是血細(xì)胞濃度增加，或紅細(xì)胞剛性增高（變形能力降低）；（2）全血低切相對(duì)黏度，其增加的直接原因是血細(xì)胞濃度增加，或紅細(xì)胞聚集性增加。

TXB2是TXA2的產(chǎn)物，而TXA2是前列腺素的一種，是由血小板產(chǎn)生的具有血小板凝聚及血管收縮的作用的生物活性物質(zhì)，其半衰期只有30 s，產(chǎn)生后會(huì)迅速轉(zhuǎn)化為無活性的TXB2[17]。6-keto-PGF1α是PGI2的代謝產(chǎn)物，而PGI2是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成后釋放出的抗血小板聚集和舒張血管的一種生物活性物質(zhì)，同樣地，PGI2半衰期很短，會(huì)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定無活性的6-keto-PGF1α。TXA2/PGI2比值高易導(dǎo)致血小板聚集，血栓形成，促進(jìn)動(dòng)脈硬化和冠心病[18]。而通過檢測穩(wěn)定物質(zhì)TXB2和6-keto-PGF1α的比值水平就可以間接了解TXA2和PGI2的水平。

造模給藥60 d后取材時(shí)，模型組大鼠腹主動(dòng)脈血液明顯較其他組黏稠且已凝固，從表征指標(biāo)上看，黃芪豆豉高、中劑量組優(yōu)于模型組氣虛血瘀大鼠，從血液流變學(xué)指標(biāo)上看，黃芪豆豉高、中劑量組的數(shù)據(jù)均證明服用黃芪豆豉可以明顯改善氣虛血瘀大鼠的血液黏度，表明了黃芪豆豉具有益氣活血作用。