芹菜素對高糖環境下人紅細胞氧化損傷的保護作用

李怡斯，陳麗詩，黃熙照，張珊珊，宋豐林

廣東藥科大學食品科學學院（中山 528458）

芹菜素（apigenin，APG）是一種廣泛存在于多種水果、蔬菜及茶葉中的天然黃酮類化合物。研究證明芹菜素具有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成、抗腫瘤等作用[1]。在糖尿病大鼠模型中，芹菜素能通過抑制二肽基肽酶4（DPP-4）的活性，減輕胰島細胞氧化應激、保護胰島β細胞線粒體膜免受損傷等作用機制，降低糖尿病大鼠血糖水平[2-4]。

糖尿病是一種以血糖水平異常增高為主要特征的代謝性疾病，長期持續高血糖是糖尿病患者慢性血管并發癥的主要原因[5]，并且會導致心臟、眼睛、腎臟和神經等器官的病變[6]。長期血糖升高對紅細胞和血管內皮細胞，還有毛細血管壁造成損傷，導致紅細胞膜的硬度增強，不利于紅細胞的生理功能的發揮，尤其在微循環方面。紅細胞過多聚集導致全血黏度升高，使得血管微循環發生障礙，這是誘發糖尿病血管并發癥的主要原因。若長期糖耐量減低和控制血糖不當也會導致微血管并發癥的發生[7]。

糖尿病會導致紅細胞的血紅蛋白和膜蛋白上出現不正常的糖化作用。高血糖擾亂了細胞的抗氧化防御體系，主要通過葡萄糖氧化、蛋白質的非酶糖基化及糖化蛋白質的氧化降解產生自由基的途徑。組織中糖基化終產物（advanced glycation end-products，AGEs）的產生和積累與糖尿病及其并發癥有關，AGEs與受體的結合導致細胞信號的改變和自由基的進一步產生，改變蛋白質和細胞的功能；血紅蛋白對葡萄糖損傷尤其敏感，并且會導致血紅素的完全破壞，高血糖導致的應激可以產生活性氧族（reactive oxygen species，ROS），進而改變血紅蛋白的結構和功能[8]。

糖尿病治療的目標是通過控制高血糖和代謝紊亂以消除糖尿病癥狀和防止出現并發癥[9]，因此，臨床治療主要以藥物控制血糖為主，以此來完成對患者血糖的有效控制，改善血糖指標，降低并發癥發生率，取得良好的血糖控制效果[6]。試驗通過在體外建立紅細胞高糖損傷模型，以芹菜素作為干預物進行研究，通過紅細胞溶血率、糖化血紅蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）、丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等相關指標的測定來研究芹菜素對紅細胞高糖損傷的保護作用，并探討芹菜素可能的作用機制，為芹菜素用于防治2型糖尿病相關并發癥提供研究基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芹菜素標準品（CAS No.520-36-5，純度≥98%，中國阿拉丁公司）；糖化血紅蛋白（A056-1-1）、MDA測定試劑盒（A003-2）、GSH測定盒（A006-2-1）、CAT測定試劑盒（A007-1-1）、SOD測定試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）；0.01 mol/L PBS緩沖液（南京建成生物工程研究所）；CM-H2DCFDA ROS熒光探針（美國英杰生命技術有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅細胞懸液制備與干預

紅細胞懸液的制備：采集健康志愿者外周血，置于枸緣酸鈉抗凝管中，以28 ℃，3 000 r/min離心10min，去除血漿和中間白細胞層。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌紅細胞3次，用PBS配成體積分數1%，4%和40%的紅細胞懸液。

紅細胞懸液分為對照組、高糖損傷模型組（模型組）、芹菜素不同劑量組（終濃度20，40和80 μmol/L），具體為：對照組，6 mmol/L葡萄糖干預；高糖損傷模型組，50 mmol/L葡萄糖干預；低劑量芹菜素干預組，50 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L芹菜素；中劑量芹菜素干預組，50 mmol/L葡萄糖+40 μmol/L芹菜素；高劑量芹菜素干預組：50 mmol/L葡萄糖+80 μmol/L芹菜素。芹菜素干預組的紅細胞懸液中分別加入不同劑量的芹菜素，使紅細胞與干預物充分混勻后于37 ℃孵育30 min。除對照組外，其他各組紅細胞中加入50 mmol/L葡萄糖，于37 ℃ 繼續孵育24 h。

1.2.2 紅細胞溶血率的測定

紅細胞受到氧化損傷會導致其結構不完整，細胞膜破裂，引發溶血反應，胞內血紅蛋白流出，致使培養的細胞懸液上清液呈現淡紅色或紅色。干預完成后的紅細胞懸液用PBS按照1∶4（V/V）進行稀釋，以3 000 r/min離心5 min，取200 μL上層清液測定其在540 nm波長下吸光度A。同時用預冷雙蒸水處理紅細胞培養液并置于冰上反應5 min，作為100%溶血對照，測定全溶血對照紅細胞的吸光度A0，按式（1）計算各個試驗組的紅細胞溶血率。

式中：A為添加不同濃度芹菜素的樣品測得的吸光度；A0為全溶血測得的吸光度。

1.2.3 糖化血紅蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）的測定

GHb含量可以反映機體的血糖情況，在試驗研究中可以反映紅細胞的損傷程度。試驗將各試驗組的紅細胞懸液上清與沉淀混勻，用雙蒸水按照1∶4（V/V）進行混合制備溶血液，置于冰上5min使紅細胞完全破裂。根據試劑盒提供試驗方法對GHb進行測定。

1.2.4 MDA、GSH和ROS含量的測定

取干預后的40%紅細胞懸液，與預冷的雙蒸水按1∶4（V/V）混勻后，冰浴5 min使紅細胞充分溶血。按照MDA和GSH檢測試劑盒說明書進行測定。另取1%紅細胞懸液孵育完成后，加入終濃度10 μmol/L的ROS熒光探針CM-H2DCFDA，充分混勻后于37 ℃避光孵育30 min，以PBS洗滌3次，充分洗去未進入細胞的熒光探針，洗滌后的紅細胞用PBS重懸，于流式細胞儀中測定紅細胞ROS水平。

1.2.5 紅細胞抗氧化酶活性的測定

40%紅細胞溶液按照1.2方法進行處理，孵育完成后加入預冷的雙蒸水使紅細胞完全裂解，按照試劑盒說明進行紅細胞內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的檢測。

1.3 數據處理

數據采用SPSS 23.0統計學軟件進行統計學分析，所有數據均表示為均數±標準差，單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），組間比較采用LSD-t檢驗進行分析，P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 芹菜素降低紅細胞溶血率

紅細胞孵育完成后，檢測得到對照組紅細胞溶血率為8.91%±1.81%，模型組紅細胞溶血率較對照組明顯升高，達16.78%±1.90%，且差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，芹菜素干預組紅細胞的溶血率均有降低，20，40和80 μmol/L組溶血率分別為15.45%±1.63%，13.63%±1.73%和12.41%±1.67%，其中40和80 μmol/L組與模型組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 芹菜素對紅細胞溶血率的影響

2.2 芹菜素降低紅細胞GHb

如圖2所示，50 mmol/L葡萄糖孵育后，紅細胞GHb含量為7.53%±0.45%，與對照組（3.58%±0.41%）相比顯著升高（P＜0.05）。20，40和80 μmol/L芹菜素干預后，紅細胞GHb含量分別為6.89%±0.60%，6.30%±0.61%和5.18%±0.85%，與模型組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 芹菜素對紅細胞GHb的影響

2.3 芹菜素降低紅細胞MDA、ROS生成并提高GSH含量

如圖3（A）所示，與對照組相比，50 mmol/L葡萄糖孵育后紅細胞中的MDA含量顯著升高（P＜0.01），紅細胞中ROS平均熒光強度也較對照組明顯升高（圖3 C），且差異具有統計學意義（P＜0.05）。與葡萄糖損傷組相比，中、高劑量芹菜素干預均能有效降低高糖環境下紅細胞MDA和ROS的生成（P＜0.01）。

圖3 芹菜素對紅細胞MDA、ROS、GSH含量的影響

GSH在保護紅細胞免受氧化損傷方面起著非常重要的作用。由圖3（B）可知，高糖孵育使紅細胞中GSH含量降低至0.79±0.30 nmol/mg Hb，與對照組（4.58±1.09 nmol/mg Hb）相比差異具有統計學意義（P＜0.01）。20，40和80 μmol/L芹菜素干預后，紅細胞GSH含量分別為0.98±0.44，1.59±0.43和2.16±0.43 nmol/mg Hb，其中40和80 μmol/L芹菜素干預組與模型組相比差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 芹菜素提高紅細胞抗氧化酶活性

紅細胞中SOD、CAT、GSH-Px在細胞抗氧化中發揮重要作用。由圖4可知，與正常組相比，高糖損傷組紅細胞內SOD、CAT、GSH-Px酶活性均受到明顯抑制（P＜0.05）。與葡萄糖損傷組相比，芹菜素干預后紅細胞中SOD的活性均顯著提高（P＜0.05）。40和80 μmol/L芹菜素干預后，紅細胞CAT活性分別升高至190.80±36.02和219.60±29.45 U/g Hb，與高糖損傷組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。對照組紅細胞GSH-Px活性為81.90±5.37 U/g Hb，在高糖損傷組紅細胞中其活性降低至63.81±6.74 U/g Hb，芹菜素可提高GSH-Px活性，其中80 μmol/L芹菜素干預組紅細胞GSH-Px活性為74.00±5.57 U/g Hb，與高糖損傷組相比差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 芹菜素對紅細胞SOD、CAT、GSH-Px活性的影響

3 討論

紅細胞（red blood cells，RBCs）形如雙凹圓盤，循環于全身組織器官并發揮氣體交換的重要生理功能。在這一過程中，RBCs不斷遭到ROS攻擊，導致其漸進損傷和最終衰老，主要原因是RBCs的特殊結構。紅細胞膜脂質富含不飽和脂肪酸，而多不飽和脂肪酸含有雙鍵，持續暴露于高氧水平極易被過氧化。紅細胞總蛋白的95%為富含自由基反應的催化劑Fe2+的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）。成熟紅細胞無線粒體等細胞器，無法通過線粒體來消除ROS，所以損傷后很難自我修復[10]。紅細胞的重要生理作用和特殊結構，使其更易受氧化應激損傷，因此其通常用作氧化應激研究的理想細胞模型。如果血液中血糖過高，便會結合蛋白質包裹住紅細胞，使紅細胞粘結在一起，增高血液的黏稠度，進而使血液循環減慢[7]。紅細胞損傷是糖尿病并發癥中的較為嚴重的一類，因此，利用紅細胞進行抗氧化研究具有關鍵作用。

有研究結果指出，氧化應激是引發2型糖尿病和加重病情的重要因素[11]。機體內存在固有的清除和抑制自由基反應的體系，正常情況下保持氧化還原內穩態，機體產生ROS和抗氧化能力存在內穩態平衡。氧化應激是指ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）在機體內堆積過多，與抗氧化防御系統的清除之間失衡導致ROS和RNS過量產生，造成機體核酸和組織細胞及蛋白等大分子物質的損傷[12]。長期高血糖可通過線粒體電子傳遞鏈[13]、葡萄糖多元醇通路[14]和自氧化等途徑增加機體內的ROS與RNS含量，從而導致氧化應激。機體抗氧化的初級防御系統是由酶類和非酶類抗氧化系統發揮清除和抑制自由基作用所構成。酶類抗氧化系統是體內的第一道抗氧化防線。線粒體電子傳遞鏈主要涉及酶復合物Ⅰ～Ⅳ、細胞色素c和輔酶Q，在酶復合物Ⅰ和Ⅲ中會持續產生少量的超氧產物，包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基，而SOD、CAT和GPx會對超氧產物進行催化將其轉化成水和氧氣。但如果在高血糖或者肥胖的情況下，超氧產物就會出現大幅增加的現象，當其清除速率不及產生速率時便會引發氧化應激[15]。體內第二道防線是非酶類抗氧化系統，它由小分子抗氧化物質組成，包括水溶性抗氧化劑GSH、蛋白抗氧化劑膽紅素、脂溶性抗氧化劑維生素E、低分子化合物尿酸鹽、植物化學物質、內源性褪黑素等。SOD、CAT和GSH等可將機體內多余的自由基清除，從而維持機體的氧化還原平衡[15-16]。因此，試驗測定SOD、CAT、GSH-Px的活性和GSH含量，結果表明紅細胞經高濃度芹菜素（80 μmol/L）干預后，紅細胞中SOD、GSH-Px、GSH活性或含量均顯著提高，但是CAT和GSH-Px活性不能恢復到對照組的正常水平，提示芹菜素可能通過提高紅細胞內抗氧化酶活性發揮抗氧化作用。

紅細胞膜脂質中不飽和高級脂肪酸被氧化，產生脂質過氧化物MDA，MDA是具有很強生物毒性的羰基化合物，極易與細胞膜磷脂、蛋白質等發生羰——氨交聯反應，造成細胞膜結構的破壞和生理功能的喪失，最終導致細胞凋亡。MDA作為細胞膜脂質過氧化產物，是自由基致細胞損傷的標記物之一，能直接地反映體內自由基水平及脂質過氧化程度[17-18]。有研究表明，氧化應激條件下，紅細胞中MDA的含量明顯增加[19-20]，這與試驗結果相吻合。芹菜素能在一定程度上顯著降低MDA的含量，提示芹菜素可能抑制血紅蛋白的氧化和不飽和高級脂肪酸的氧化，發揮對紅細胞的保護作用，且能夠保護紅細胞免受自由基的損傷。

糖尿病患者的抗氧化能力降低，且其體內血漿和紅細胞中過氧化產物的水平較正常人高。ROS是生物有氧代謝過程中的一種中間產物，對脂質、蛋白質和核酸具有潛在的氧化損傷能力[21-22]，當體內的抗氧化酶系（SOD、CAT和GSH-Px等）無法將其及時清除時，ROS便會因累積過多而對細胞和組織造成破壞，加重細胞損傷[19,23-25]。ROS可引起膜脂質過氧化使細胞膜通透性提高和功能的缺陷，誘發DNA損傷導致突變和死亡，富含巰基的蛋白質交聯和硫化，致使非彈性老化蛋白的產生，特別是存在于細胞外基質的膠原。試驗表明，芹菜素能有效降低ROS的產生，從而減輕自由基和活性氧對紅細胞的破壞，起到抗氧化作用。

4 結論

結果顯示：芹菜素能夠抑制高濃度葡萄糖氧化損傷引起的紅細胞溶血，降低紅細胞中GHb、MDA和ROS的含量，提高紅細胞中GSH-Px、SOD、CAT活性和GSH含量，提示芹菜素可能通過提高紅細胞內抗氧防御化能力對高濃度葡萄糖導致的紅細胞氧化損傷發揮保護作用。綜上，芹菜素可能對糖尿病相關并發癥的發生具有一定預防保護作用，表明其作為食品功能性成分，在膳食預防和緩解糖尿病并發癥方面有廣闊的應用遠景，可對膳食防治糖尿病提供理論與方法指導。