基于高通量基因測序分析火鍋蘸料原料微生物多樣性

張隋鑫，陳臘梅，王宇，楊瑞香，薩如拉，紀(jì)曉梅

內(nèi)蒙古草原紅太陽食品股份有限公司（呼和浩特 010000）

火鍋是近年來風(fēng)靡全國各地的美食，火鍋蘸料是火鍋的靈魂搭配，它可與肉類、豆制品、蔬菜等搭配，緩解火鍋帶來的辛辣感、刺激感[1]。火鍋蘸料產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味將直接影響消費者對火鍋食用興趣[2]。火鍋蘸料的原料種類復(fù)雜，原料微生物是影響食品生產(chǎn)的基礎(chǔ)，未殺滅的微生物會在食品中繼續(xù)繁殖導(dǎo)致食品腐敗，在生產(chǎn)過程中若出現(xiàn)滅菌不徹底，易出現(xiàn)食品安全問題。國內(nèi)外對于火鍋類產(chǎn)品的研究主要集中在對火鍋底料生產(chǎn)工藝優(yōu)化、新品的開發(fā)等方面[3-7]，對于火鍋蘸料原料微生物方向的相關(guān)研究還比較少[8]。

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）是一種高效便捷檢測樣品DNA分子的方法，它代替?zhèn)鹘y(tǒng)繁瑣的檢測步驟[9]，在檢測樣品時具有需求量少、檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確率高等優(yōu)點[10]，但其無法對產(chǎn)品中的微生物是否還存活進(jìn)行判斷。高通量測序可針對不同食物中的復(fù)雜微生物進(jìn)行準(zhǔn)確識別，被廣泛應(yīng)用于多種食品中，如豆豉[11]、泡菜[12]、酸菜[13]、發(fā)酵香腸[14]、腐乳[15]等。近年來利用該項技術(shù)對微生物分子生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究成為首選的方法[16]。試驗采用高通量測序技術(shù)，探究蘸料原料的微生物菌群組成，了解原料中的優(yōu)勢菌種，從而為提高生產(chǎn)過程中的安全性和穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（A）蘸料半成品、（B）花生醬（花生仁經(jīng)烘烤研磨后制得）、（C）韭菜花（韭菜花經(jīng)腌制后獲得）、（D）香辛料（桂皮、姜粉、茴香等）、（E）大豆粉（黃豆經(jīng)烘烤后研磨制得），均由內(nèi)蒙古呼和浩特市草原紅太陽食品股份有限公司提供。

Q10212 Qubit3.0 DNA檢測試劑盒（美國Life Technologies公司）；M5635-02 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit（美國OMEGA公司）；P111-03 2×Taq Master Mix（中國Vazyme公司）；EC401-03 MagicPure Size Selection DNA Beads（中國TransGen Biotech公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺式離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；GL-88B漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；DYCZ-21電泳槽（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP）EC3 310；T100TM Thermal Cyeler PCR儀（美國BIO-RAD公司）；Research plus 0.5～10 μL移液器（中國Eppendorf公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取200 mg原料樣品，分別將5種原料加入已滅菌的離心管中，向離心管中加入1 mL 70%乙醇溶液，充分振蕩使樣品混合均勻，在10 000 r/min轉(zhuǎn)速、室溫下離心3 min，將上層液體棄置。向離心管中加入1倍的磷酸鹽緩沖液，充分振蕩使樣品混合均勻，在10 000 r/min轉(zhuǎn)速、室溫下離心3 min，將上清液棄置。將離心管倒置于濾紙上方，保持1 min，直至離心管內(nèi)沒有液體流出。將樣品管在50 ℃烘箱靜置10 min，使離心管內(nèi)殘留的乙醇溶液完全揮發(fā)。

1.3.2 DNA提取

將蘸料半成品（A）、花生醬（B）、韭菜醬（C）、香辛料（D）、大豆粉（E）編號的火鍋蘸料原料樣品分別攪拌均勻，參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書，結(jié)合SDS裂解液凍融法對5種原料進(jìn)行DNA提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，條帶清晰即可進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測序

利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，明確PCR反應(yīng)需加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合Miseq測序平臺的V3-V4通用引物[17]：341F引物，CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物，GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC，進(jìn)行擴(kuò)增。DNA模板10 μL，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），H2O 30 μL。將配制好的PCR體系進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃保持3 min后分別進(jìn)行變性、退火及延申操作，循環(huán)5次（變性溫度94 ℃、時間30 s，退火溫度45 ℃、設(shè)定時間20 s，延伸溫度65 ℃、時間30 s）；進(jìn)行變性、退火及延申操作，循環(huán)20次（變性溫度94 ℃、時間20 s，退火溫度55 ℃、時間20 s，延伸溫度72 ℃、時間30 s）；延伸操作（溫度72 ℃保持5 min）。

第2輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR 產(chǎn)物（第1輪）20 ng，高保真PCR試劑15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），H2O 30 μL。將配制好的PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度95 ℃、時間3 min，分別進(jìn)行變性、退火、延伸操作，循環(huán)5次（變性溫度94 ℃、時間20 s，退火溫度55 ℃、時間20 s，延伸溫度72 ℃、時間30 s），最終進(jìn)行延伸操作（溫度72 ℃、時間5 min），經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。使用Qubit 3.0檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，在Illlumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平臺進(jìn)行雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于Illumina Miseq平臺測序得到的樣品文庫，根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù)，對樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。將最終優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，根據(jù)分析結(jié)果，采用Mothur 計算分析樣品的Alpha多樣性，分別繪制樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖、Heatmap熱圖、結(jié)合基于bary-curtis距離算法的PCA圖，分析微生物結(jié)構(gòu)組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 火鍋蘸料5種原料瓊脂凝膠電泳鑒定

火鍋蘸料5種原料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。5個蘸料原料樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在600 bp左右，與設(shè)計引物擴(kuò)增長度接近，且其特異性和亮度均較好，可滿足測序要求。

圖1 細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.2 火鍋蘸料主要原料的測序結(jié)果質(zhì)量分析

采用高通量測序獲得火鍋蘸料原料樣品的原始序列數(shù)據(jù)后，得到5個樣品細(xì)測的序列，共2 706 867條，其中樣本細(xì)菌長度分布在425～446 bp，通過過濾篩除低質(zhì)量序列，得到有效序列，共253 345條，長度分布在406～409 bp。數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理，最終得到的優(yōu)質(zhì)細(xì)菌序列分布統(tǒng)計見表1。

表1 細(xì)菌序列信息

2.3 蘸料中5種原料微生物多樣性的分析

2.3.1 樣品的OTU統(tǒng)計及分析

采用OUT統(tǒng)計工具，將幾個樣本的測序結(jié)果按照操作提示錄入工具中，分別對測序結(jié)果篩選出來的細(xì)菌真菌有效序列進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖2所示。樣品細(xì)菌在OTU聚類后共得到1 732個OTUs，5個原料樣品中有3個OTUs為原料共有，樣品A特有OUT 151個，B特有OUT 105個，C特有31個，D特有442個，E特有16個，5個檢測樣本共有OUT 3個。

圖2 樣品OTU分布韋恩圖

2.3.2α多樣性分析

α多樣性常用的度量標(biāo)準(zhǔn)包括Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和覆蓋率。Sobs指數(shù)是指觀測到的樣本OTU數(shù)量，OTU數(shù)量可以代表樣品物種的豐富度，每個OTU對應(yīng)不同的微生物種[18]。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示樣品的多樣性[19]，ACE指數(shù)和Chao指數(shù)表示物種的豐富度，通過檢測和測序得到物種的覆蓋率。Chao、ACE指數(shù)用于計算菌群豐度（community richness），二者指數(shù)越大，說明群落豐富度越高[20-21]。Shannon的值越大，說明檢測樣本的群落多樣性越高，Simpson的指數(shù)值越大，則說明檢測樣本其群落多樣性越低[22]。

如表2所示，樣品D（香辛料）Shannon指數(shù)為3.87，明顯較其他原料高，而樣品B的Shannon指數(shù)較低，為2.00，且樣品A的Shannon指數(shù)為2.12，樣品E的Shannon指數(shù)為2.11，較相近并大于樣品B的2.00，說明樣品D中細(xì)菌群落的多樣性較高、種類多，且樣品D的ACE指數(shù)為388.29，Chao指數(shù)為2 124.40，也間接說明樣品D香辛料中所含的物種豐富度較好，可能原因是原料自帶的微生物較多，原料的生長環(huán)境也更適宜細(xì)菌生長繁殖，因此在生產(chǎn)中不但要加強(qiáng)原料的滅菌，還要著重把控好環(huán)境中的微生物。樣品B的Simpson指數(shù)較高，Shannon指數(shù)較低，也說明該原料中細(xì)菌群落多樣性較少，主要原因為原料較為單一。

表2 細(xì)菌α多樣性指數(shù)

由圖3的Rank abundance曲線可知，5個樣品曲線跨度均較大，說明5種原料的微生物組成均較為豐富，均勻程度較高，其中大豆粉（E）的曲線水平跨度最低，曲線也較為平緩，說明微生物的豐富度較低，而樣品香辛料（D）的水平跨度較大，曲線較為平緩，說明其原料中微生物的物種組成較為豐富，花生醬（B）的樣品物種數(shù)量下滑曲線平滑，且曲跨度較小，說明較蘸料半成品（A）、韭菜花（C）、香辛料（D）、大豆粉（E）要好，也更加說明原料B（花生醬）的優(yōu)勢菌群占比較高，可能由于原料中的某一種或幾種微生物所占比例較大，該原料的優(yōu)勢菌群占比較高，也間接說明該原料中的微生物多樣性較低。

圖3 高通量測序樣本的Rank-abundance曲線

2.3.3 基于屬水平的火鍋蘸料原料菌群結(jié)構(gòu)分析

在屬分類水平上，5個火鍋蘸料原料樣本共檢測到21個細(xì)菌屬。從圖4可以看出，假單胞菌屬（Pseudomonas）和黃桿菌屬（Xanthomonas）是5種原料中的絕對優(yōu)勢菌屬，假單胞菌屬（Pseudomonas）具有重要且多樣的生態(tài)功能，更重要的是假單胞菌具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，分布十分廣泛，其生長溫度、pH適應(yīng)范圍較大[23]。Pseudomonas除D（香辛料）中占比在20%左右外，其余原料中均占到50%以上。原料D（香辛料）中的優(yōu)勢菌屬為泛菌屬（Pantoea），屬于兼性厭氧菌，因此在進(jìn)行生產(chǎn)過程中要著重注意該原料的滅菌時間及溫度。

圖4 細(xì)菌屬水平的群落分類學(xué)組成和相對豐度分布

在屬分類水平下，將火鍋蘸料5種原料的細(xì)菌的群落組成按照最大相對豐度順序排序，并繪制5種原料的物種豐度聚類熱圖，如圖5所示。Heatmap圖是以顏色梯度來表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小[24]，并呈現(xiàn)群落物種組成及物種的豐度信息，通過利用顏色的深淺變化方式反映所檢測樣本的細(xì)菌群落分布的豐度值[25]。從圖5可以看出，韭菜花（C）和大豆粉（E）樣品的細(xì)菌菌群豐度值較為接近，且相對豐度較小。而原料A（蘸料半成品）與原料B（花生醬）樣品的相對豐度較大，主要是以假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）為主，在火鍋蘸料主要原料中原料D（香辛料）的細(xì)菌菌群豐度與其他原料的菌群豐度有較明顯的差異，原料D（香辛料）主要是以泛菌屬（Pantoea）和耶爾森菌屬（Yersinia）等為主。通過Heatmap圖分析表明，火鍋蘸料5種原料樣品中的細(xì)菌菌群豐度存在明顯差異，說明不同原料在生產(chǎn)過程中所需的滅菌溫度和時間需有針對性地把控，以保障產(chǎn)品生產(chǎn)安全。

圖5 細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖

2.3.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

X軸和Y軸表示2個選定的主成分軸，百分比表示主成分對樣本組成差異的解釋度值，通過主成分PCA分析，可以觀察各樣本間的離散和聚集情況[26]。圖6中有5種形狀方向各異的小圖形，這些小圖形分別表示火鍋蘸料5種原料的樣本來源，各點之間的距離大小，反映相應(yīng)樣本之間的菌群差異情況[27]。反之，若2個點之間的距離較為相近，則表明2個樣本的物種組成越相似[28]。

圖6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的PCA分析

基于屬水平條件對火鍋蘸料的5種原料進(jìn)行主成分（PCA）分析，分析結(jié)果如圖6所示。PCA1的貢獻(xiàn)率為89%，PCA2的貢獻(xiàn)率為9%。在PCA分析結(jié)果中，樣本B和樣品A之間距離較小，表明這2種原料的原始菌落組成差異較小，而原料D樣品距其他樣品的距離較遠(yuǎn)，說明該原料樣本的菌落組成與其他4種原料差異較大，分析原因可能是原料D為農(nóng)業(yè)原料組成，生長環(huán)境較復(fù)雜，菌屬涵蓋范圍較大。從整體看，5種原料微生物差異較大。根據(jù)圖6可知，B、A樣品菌群結(jié)構(gòu)相近，與C、E原料樣品的差異較小，與D原料的差異較大。這與屬水平群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖結(jié)果相同。

3 討論與結(jié)論

采用高通量測序法對紅太陽火鍋蘸料5種主要原料的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，結(jié)合α多樣性分析和Heatmap圖表明，5種原料的菌群組成非常復(fù)雜，種類多，數(shù)量大，范圍廣。食品腐敗的主要原因是產(chǎn)品中殘留的微生物的代謝活動引起的食品酸敗變質(zhì)，利用高通量基因測序技術(shù)對火鍋蘸料中5種主要原料微生物的多樣性和豐度進(jìn)行鑒定，分析可能影響火鍋蘸料品質(zhì)的菌株，為火鍋蘸料生產(chǎn)過程的把控提供理論支持，為火鍋蘸料的安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。在火鍋蘸料的5種原料中假單胞菌屬（Pseudomonas）都是優(yōu)勢菌種，而假單胞菌屬（Pseudomonas）是一種腐敗微生物，其含量超標(biāo)在食用時會對人體健康造成一定影響。

通過高通量基因測序在蘸料原料中發(fā)現(xiàn)大量假單胞菌屬（Pseudomonas），且有報道證明人體在食用含有假單胞菌屬（Pseudomonas）食物會導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生[29-31]，而一些原料中自帶的微生物為不可控因素，無法在入場時保障菌落總數(shù)＜10 CFU，但在生產(chǎn)過程中此類微生物均可通過高壓滅菌處理殺滅。通過高通量測序技術(shù)對火鍋蘸料的微生物進(jìn)行鑒定，了解火鍋蘸料5種主要原料的微生物菌群結(jié)構(gòu)組成多樣性，可在其他種類蘸料生產(chǎn)中參考此原料的主要優(yōu)勢菌種，根據(jù)這些微生物的生存特性對其進(jìn)行控制，并殺滅有害菌群，保障食品生產(chǎn)的安全性。