地參發(fā)酵酒的揮發(fā)性成分分析和體外抗氧化活性研究

伍蓉，黃小蘭，何旭峰，周祥德，熊雙，張椿翊

重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所（重慶 404100）

地參為唇形科地筍屬植物毛葉地筍Lycopus lucidusvar.hirtusRegel.的根莖，因其形狀、營(yíng)養(yǎng)與人參相似而得名，又名蟲草參[1]，屬食藥兩用植物，具有繁殖能力強(qiáng)、產(chǎn)量高及營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)大部分地區(qū)都有種植[2]。食用地參具有生津開胃、益氣養(yǎng)血、補(bǔ)肝腎兩虛、強(qiáng)腰膝筋骨等功效[3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)地參的營(yíng)養(yǎng)成分、化學(xué)成分和生物活性[2,4-6]已有較全面的研究，其潛在的保健價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值也逐漸被人們所了解，但在其開發(fā)利用上仍以醬菜、油炸等粗放型加工方式為主，深加工利用不足。

研究表明，地參良好的抗氧化活性與其豐富的多糖[3,6]、酚類[7]物質(zhì)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，重慶萬(wàn)州產(chǎn)地參中迷迭香酸、丹參素等酚酸類物質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地[8]，為地參的深加工奠定了理論基礎(chǔ)。地參發(fā)酵酒是以重慶萬(wàn)州產(chǎn)地參和糯米為原料發(fā)酵制得，在發(fā)酵過程中，多糖類物質(zhì)被微生物利用產(chǎn)生酒精，而酚類物質(zhì)則得以保留并最大限度地釋放到酒里，使地參發(fā)酵酒具有一定的保健價(jià)值。因此，研究將采用福林酚比色法測(cè)定地參發(fā)酵酒中總酚含量；頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）檢測(cè)分析地參發(fā)酵酒中揮發(fā)性成分，為其特征香氣成分的研究、風(fēng)味調(diào)整奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)采用科學(xué)手段對(duì)地參發(fā)酵酒的還原力，羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除率等體外抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，不僅為地參發(fā)酵酒的保健價(jià)值提供理論依據(jù)，也為地參的深度開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參發(fā)酵酒（實(shí)驗(yàn)室自制）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸（99.0%，北京曼哈格生物有限公司）；抗壞血酸（優(yōu)級(jí)純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；硫酸亞鐵、過硫酸鉀、過氧化氫溶液、水楊酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水碳酸鈉、福林酚B液（1 mol/L），均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7000 C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫儀器公司）；頂空固相微萃取頭（Divinylbenzenne/Carboxen/PDMS，50 μm，美國(guó)Supelco公司）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HWS型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HB10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀（德國(guó)IKA公司）；SHAKERS型多位漩渦振蕩器（德國(guó)海道夫公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)（密理博中國(guó)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 地參發(fā)酵酒的制備

取鮮地參洗凈泥沙，自然晾干水分至50%左右，打碎成米粒大小，與糯米按照一定比例混合，按工藝流程進(jìn)行制備（酒曲接種量0.50%，發(fā)酵溫度27 ℃，發(fā)酵時(shí)間9 d）。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

取20 mL地參發(fā)酵酒于離心管中，加入乙酸乙酯渦旋提取3次，每次20 mL，合并上層提取液于雞心瓶中，40 ℃旋蒸蒸發(fā)至近干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得地參發(fā)酵酒總酚溶液。

采用福林酚比色法[9]測(cè)定總酚含量，并稍作修改。精密稱取0.019 93 g沒食子酸于100 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.197 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL上述溶液于10 mL比色管中，加4.00 mL純水和0.10 mL福林酚B液，充分混勻，室溫反應(yīng)3 min，再加入0.60 mL 20%無(wú)水碳酸鈉溶液，用純水補(bǔ)至5.00 mL，搖勻，室溫反應(yīng)2 h，然后在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度。吸取0.10 mL地參發(fā)酵酒總酚溶液于10 mL比色管中后，與沒食子酸同法操作，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.3.3 揮發(fā)性成分的測(cè)定

1.3.3.1 樣品溶液制備

精密吸取10 mL地參發(fā)酵酒樣置于20 mL頂空瓶中，加入2.5 g NaCl，于保溫套50 ℃加熱平衡20 min后，將已老化好的萃取頭插入頂空瓶中，纖維頭位于液面上約1.0 cm，攪拌速度為500 r/min，吸附20 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，230 ℃解吸5 min，拔出萃取頭時(shí)及時(shí)抽回纖維頭，并啟動(dòng)采集數(shù)據(jù)。

1.3.3.2 氣相條件

色譜柱為賽默飛石英毛細(xì)管柱TG-WAXMS（30m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升溫至160 ℃，然后以5 ℃/min升溫至240 ℃，保持20 min。載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230 ℃。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

離子源為電子電離源（electron ionization，EI），離子源溫度240 ℃，傳輸線溫度240 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z40～500，溶劑延遲時(shí)間5 min。

1.3.4 體外抗氧化活性的研究

1.3.4.1 羥基自由基清除率

參照Sankar等[10]的方法，分別吸取0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，1.50和2.00 mL地參發(fā)酵酒，用純水補(bǔ)至2.00 mL，依次加入FeSO4溶液（9 mmol/L）、水楊酸乙醇溶液（9 mmoL/L）和H2O2溶液（9 mmol/L）后搖勻，在37 ℃水浴加熱15 min后測(cè)定吸光度Ai；以純水代替樣品作為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度A0；為扣除地參發(fā)酵酒的本底顏色，除不加H2O2溶液外，其余操作同地參發(fā)酵酒樣品，測(cè)得吸光度Aj；同時(shí)采用0.1%抗壞血酸溶液為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率按式（1）計(jì)算。

1.3.4.2 還原力測(cè)定

參照Prommaban等[11]的方法，分別吸取0.20，0.40，0.80，1.20，1.60和2.00 mL地參發(fā)酵酒，用純水補(bǔ)至2.00 mL，依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀溶液（10 g/L），搖勻，于50 ℃水浴加熱30 min，取出迅速冷卻，加入1 mL三氯乙酸（100 g/L），搖勻，靜置10 min。取2.0 mL上述反應(yīng)液加入0.5 mL三氯化鐵（1 g/L），再加入3.5 mL純水，振蕩混勻，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，同時(shí)采用0.1%抗壞血酸溶液為陽(yáng)性對(duì)照，其吸光度大小表示還原力大小。

1.3.4.3 DPPH自由基清除率

參照J(rèn)o等[12]的方法，稱取8.7 mg DPPH，用100.0 mL無(wú)水乙醇溶解，得0.2 mmol/L的DPPH溶液。取地參發(fā)酵酒，稀釋5倍，分別吸取0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00和1.20 mL稀釋樣品，用純水補(bǔ)至2.00mL，再分別加入2 mL DPPH乙醇溶液，振蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min后在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai；以純水代替樣品為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度A0，同時(shí)采用0.01%抗壞血酸溶液為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算。

1.3.4.4 ABTS自由基清除率

參照國(guó)琦等[13]的方法，稱取100.4 mg ABTS和17.2 mg過硫酸鉀，用25.0 mL純水溶解，室溫下避光放置24 h，得ABTS+母液。臨用時(shí)取適量ABTS+母液，用95%乙醇稀釋至吸光度在0.70±0.02（λ=734 nm）范圍內(nèi)，作為ABTS+使用液。取地參發(fā)酵酒，稀釋10倍，分別吸取0.02，0.04，0.08，0.12和0.16 mL稀釋樣品，用純水補(bǔ)至1.00 mL，分別加入2 mL ABTS+使用液，振蕩混勻，避光反應(yīng)5 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度Ai；以純水代替樣品為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度A0。ABTS+自由基清除率按式（3）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 地參發(fā)酵酒總酚含量結(jié)果

根據(jù)“1.3.2”小節(jié)，以沒食子酸質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=0.015 74X-0.006 57（r=0.999 7），將地參發(fā)酵酒總酚溶液的吸光度帶入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出地參發(fā)酵酒中總酚含量為128.9 mg/L。

2.2 揮發(fā)性成分分析

地參發(fā)酵酒揮發(fā)性成分通過GC-MS分析，總離子流圖如圖1所示。物質(zhì)出峰時(shí)間主要在5～70 min內(nèi)，詳細(xì)鑒定結(jié)果見表1。

表1 地參發(fā)酵酒揮發(fā)性成分的GC-MS鑒定結(jié)果

圖1 地參發(fā)酵酒中揮發(fā)性成分總離子流圖

由表1可知：共檢出6類34種揮發(fā)性成分，主要為酯類17種、醇類8種、酸類3種、酰胺類3種、酚類2種和酮類1種。各類物質(zhì)的相對(duì)含量見圖2，分別為酯類26.44%，醇類59.03%，酸類1.55%，酰胺類3.45%，酚類9.45%和酮類0.07%。其中香氣成分有24種，占比70.58%，包括醇類和酯類物質(zhì)。其次是抗氧化成分，主要包含酚類和酰胺類。

圖2 地參發(fā)酵酒不同種類揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量

通過面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量，結(jié)果顯示，地參發(fā)酵酒檢出的揮發(fā)性成分中，主要為苯乙醇、異戊醇、辛酸乙酯、2, 4-二叔丁基苯酚、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯和異丁醇，含量分別為30.01%，27.11%，11.56%，9.39%，6.75%，2.70%，2.62%和1.41%。其中醇類物質(zhì)占總揮發(fā)物質(zhì)的59.03%，主要以苯乙醇（占醇類的物質(zhì)的50.80%）、異戊醇（占醇類的物質(zhì)的45.90%）和異丁醇（占醇類的物質(zhì)的2.39%）為主，苯乙醇[14]不僅存在于天然植物中，也是發(fā)酵產(chǎn)生的特征成分，具有柔和、愉快而持久的玫瑰花香，還兼具殺菌作用。異戊醇和異丁醇作為發(fā)酵產(chǎn)生的高級(jí)醇類物質(zhì)，賦予地參發(fā)酵酒淡淡的茶香。

地參發(fā)酵酒中檢出酯類物質(zhì)最多，但從圖2可看出其含量不及醇類高，僅占總揮發(fā)性物質(zhì)的26.44%，但由于其嗅覺閾值較低[15]，因此對(duì)地參發(fā)酵酒的香氣也產(chǎn)生了較大影響，是主要的呈香物質(zhì)，包括辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯和庚酸乙酯，分別占酯類物質(zhì)含量的43.71%，25.50%，10.20%，9.92%，3.23%和1.11%。辛酸乙酯[16]具有類似白蘭地的香氣，略帶甜味，是酒中重要的香氣成分和風(fēng)味化合物，其香氣強(qiáng)度僅次于己酸乙酯。其他酯類物質(zhì)相互影響、協(xié)同作用，賦予地參發(fā)酵酒多重花果香和酒香，使其風(fēng)味獨(dú)特，風(fēng)格典型，口感飽滿。其他物質(zhì)有2, 4-二叔丁基苯酚[17]，含量為9.39%，是多種光穩(wěn)定劑、抗氧化劑的重要中間體，可作抗氧劑、穩(wěn)定劑、紫外線吸收劑，具有良好的抗氧化作用，可有效提高地參發(fā)酵酒的抗氧化能力。

2.3 體外抗氧化性

為了客觀評(píng)價(jià)地參發(fā)酵酒的體外抗氧化能力，以不同濃度的抗壞血酸溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，以其當(dāng)量進(jìn)行表示。

2.3.1 羥自由基清除能力分析

羥自由基是活性氧中最活潑的自由基，可降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，是對(duì)活細(xì)胞破壞力最強(qiáng)的自由基之一，對(duì)機(jī)體危害較大[18]。試驗(yàn)利用水楊酸與羥自由基反應(yīng)生成紫色化合物，在波長(zhǎng)510 nm處產(chǎn)生最大吸收峰，測(cè)定地參發(fā)酵酒的羥自由基清除率，結(jié)果如圖3所示。地參發(fā)酵酒和抗壞血酸的羥自由基清除率隨樣品用量的增加而增大。在0.20～1.00 mL時(shí)，地參發(fā)酵酒的清除率上升速度較抗壞血酸快；在1.50 mL時(shí)，地參發(fā)酵酒達(dá)到較高的自由基清除效果，清除率為98.50%，此時(shí)0.1%抗壞血酸的清除率為99.87%。以抗壞血酸當(dāng)量表示，地參發(fā)酵酒的羥自由基清除能力為0.986 mg/mL，即1 mL地參原酒的羥自由基清除能力相當(dāng)于0.986 mg抗壞血酸，與其他發(fā)酵酒相比，地參發(fā)酵酒清除羥自由基的能力優(yōu)于發(fā)酵型枳椇子黃酒[17]。

圖3 地參發(fā)酵酒羥自由基清除能力分析

2.3.2 還原力分析

還原力作為判斷物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)，其作用機(jī)理主要是具有強(qiáng)還原力的物質(zhì)可提供電子，一方面還原體內(nèi)氧化性物質(zhì)，另一方面與自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定物質(zhì)，從而達(dá)到抗氧化的目的[19]，吸光度越大表明還原力越強(qiáng)。如圖4所示，地參發(fā)酵酒用量與吸光度呈良好線性關(guān)系（R2=0.998 8），還原力隨用量的增加呈上升趨勢(shì)。在2.00 mL時(shí)，吸光度較高，為1.973?？箟难嵩?.20～0.80 mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.998 2），但隨著用量的繼續(xù)增加，還原力趨于穩(wěn)定，最高吸光度為2.423。以抗壞血酸當(dāng)量表示，地參發(fā)酵酒的還原力為0.814 mg/mL，即1 mL地參原酒的還原力相當(dāng)于0.814 mg抗壞血酸，明顯高于黑菊芋酒[14]。

圖4 地參發(fā)酵酒還原力分析

2.3.3 DPPH自由基清除能力分析

自然界中大部分自由基都具有活性強(qiáng)、壽命短的特征，而DPPH自由基則是一種以氮為中心的、穩(wěn)定的有機(jī)自由基，在物質(zhì)抗氧化性檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[20]。試驗(yàn)利用DPPH體系對(duì)地參發(fā)酵酒清除自由基能力進(jìn)行研究，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)用量為0.10～0.20 mL時(shí)，地參發(fā)酵酒與抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率相當(dāng)。隨著用量的增加，二者的清除率迅速提高，在0.20～0.60 mL時(shí)，抗壞血酸的提升速率較地參發(fā)酵酒快。當(dāng)用量為0.60 mL時(shí)，抗壞血酸清除率達(dá)到最大，為90.90%，地參發(fā)酵酒則在0.80 mL時(shí)達(dá)到較高清除率90.30%，清除能力優(yōu)于地參多酚[21]。以抗壞血酸當(dāng)量表示，地參發(fā)酵酒原液的DPPH自由基清除率為0.373mg/mL，即1 mL地參原酒的DPPH自由基清除能力相當(dāng)于0.373 mg抗壞血酸。

2.3.4 ABTS自由基清除能力分析

ABTS與過硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS+，當(dāng)樣品中的抗氧化活性成分與ABTS+結(jié)合時(shí)，可使藍(lán)綠色褪去，因此可用ABTS+清除率來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力[22]。地參發(fā)酵酒對(duì)ABTS自由基清除率如圖6所示。當(dāng)用量為0.02～0.16 mL時(shí)，地參發(fā)酵酒對(duì)ABTS+的清除率隨著樣品用量的增加而增大，在0.16 mL時(shí)達(dá)到較高清除率97.00%，抗壞血酸在0.08 mL達(dá)到較高清除率95.26%后增幅不大。以抗壞血酸當(dāng)量表示，地參發(fā)酵酒的DPPH自由基清除率為0.510 mg/mL，即1 mL地參原酒的DPPH自由基清除能力相當(dāng)于0.510 mg抗壞血酸。

圖6 地參發(fā)酵酒ABTS自由基清除能力分析

3 結(jié)論

研究通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)地參發(fā)酵酒中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)分析，共鑒定出揮發(fā)性成分34種，主要包含酯類、醇類、酸類、酰胺類、酚類和酮類等6類化合物。其中香氣成分24種，占比70.58%，相對(duì)含量較高的有苯乙醇、異戊醇、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯和異丁醇。其次為抗氧化成分，主要有2, 4-二叔丁基苯酚等化合物。體外抗氧化試驗(yàn)表明，在一定范圍內(nèi)，還原力吸光度和自由基清除率與地參發(fā)酵酒用量呈現(xiàn)良好的正相關(guān)關(guān)系，隨后趨于穩(wěn)定。對(duì)羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分別為98.50%，90.30%和97.00%。以抗壞血酸當(dāng)量衡量地參發(fā)酵酒在不同體系中的抗氧化能力大小，順序?yàn)榱u基自由基＞還原力＞ABTS自由基＞DPPH自由基。地參發(fā)酵酒中香氣成分豐富，富含多酚等天然抗氧化物質(zhì)，抗氧化活性強(qiáng)，保健價(jià)值突出，具有廣闊的市場(chǎng)前景，可作為一款新型保健酒進(jìn)行推廣，豐富發(fā)酵酒市場(chǎng)，讓地參產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。