咖啡產香酵母的分離鑒定及其揮發性成分分析

徐心悅，趙桐樺，萬麗瓊，羅麟霜，索玉凱*，何飛飛

1. 云南民族大學民族醫藥學院民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室（昆明 650000）；2. 云南大學資源植物研究院·農學院（昆明 650000）

咖啡豆是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物的種子，其經過烘焙后具有特殊的香氣[1]。云南是我國最大的咖啡生產區，主要種植品種為小粒咖啡（Coffea arabicaLinn.）[2]。咖啡初加工是指由咖啡鮮果制成咖啡生豆的過程，其意義在于借助微生物和咖啡中酶的作用，將咖啡內的糖類物質轉化為醇類、酸類和酮類等芳香物質，從而使咖啡豆呈現不同風味，是形成商品豆的重要環節[3-4]。

近年來，微生物發酵對咖啡風味的影響及咖啡專用發酵劑的開發成為咖啡產業的研究熱點。Wang等[5]研究表明添加葡萄糖調控乳酸乳球菌亞種（Lactococcuslactissubsp.cremoris）發酵咖啡生豆，可以顯著提高咖啡的風味品質。云南咖啡與精品咖啡豆相比，存在花果香風味不足的問題[6]。因此，開發增強咖啡花果風味的微生物發酵劑，對于提升云南咖啡的風味品質十分必要。

酵母菌作為兼性厭氧微生物，在咖啡的自然發酵過程中起著重要作用[7]。我國研究者利用外源釀酒酵母發酵改善咖啡風味，并取得一定進展[6,8]，但對于云南小粒咖啡自然發酵過程中的產香酵母尚缺乏系統挖掘。試驗從云南主要咖啡產區（保山、普洱、德宏和臨滄）的咖啡鮮果和發酵過程中篩選產香酵母，并利用氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其主要代謝產物，從而為小粒咖啡專用發酵劑的開發奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

小粒咖啡鮮果采自保山、普洱、德宏和臨滄的咖啡莊園；采摘的同一批次咖啡豆分別進行濕法處理和半干法處理，并在處理末期取樣。

1.1.2 培養基

YPD培養基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，固體培養基添加瓊脂20 g/L。發酵培養基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，果糖16.1 g/L，半乳糖0.1 g/L，甘露糖0.3 g/L，葡萄糖8.5 g/L。

1.1.3 試驗試劑

蛋白胨、酵母粉（OXOID）；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖（上海源葉生物科技有限公司）；二氯甲烷、乙酸乙酯（天津市致遠化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.1.4 試驗儀器

752N紫外可見分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）；THZ-98AB恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司）；TP600PCR儀（TaKaRa）；D-37520小型臺式離心機（德國Sigma公司）；RE-2000A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；YXQ-50S11立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；AgilengtGCMS7890B 5977A MSD氣相色譜/質譜分析聯用儀（Agilent Technologies）。

1.2 試驗方法

1.2.1 咖啡內生酵母的分離純化

咖啡鮮果經蒸餾水沖洗后，經75%乙醇漂洗5 min，經無菌水洗滌3次，并在0.1%的次氯酸鈉中浸泡10 min，再用無菌水沖洗3次。處理好的咖啡果切開后，將果皮、果肉和咖啡豆分別置于YPD培養基平板，在28 ℃條件下培養2～4 d，待樣品邊緣處長出菌落。挑取菌落進行劃線培養，從而獲得酵母菌株，并將其保存至-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 咖啡濕法發酵和半干法發酵中酵母的分離

在咖啡豆濕法發酵和半干法發酵末期分別取樣，并將樣品保存于4 ℃備用。在無菌條件下，對咖啡濕法發酵液進行梯度稀釋（10-1～10-7）。對于半干法處理的樣品，取2 g咖啡豆加入10 mL無菌水中，振蕩混勻5 min，將上清液進行梯度稀釋（10-1～10-5）。隨后，將稀釋液分別涂布于YPD培養基平板，在28 ℃條件下培養2～4 d，待平板上長出菌落，將其進行劃線培養分離。

1.2.3 產香酵母的鑒定與篩選

提取分離菌株的基因組DNA，并使用引物（上游：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’；下游：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’）擴增5.8S rRNA部分序列。基于測序結果，采用MEGA6.0軟件構建系統進化樹，從而進行分子鑒定。將酵母菌株在YPD液體培養基中活化后，以1%（V/V）接種量轉接至發酵培養基，在28 ℃，150 r/min培養36 h，篩選能夠產香氣的菌株。

1.2.4 揮發性成分的提取

產香酵母以1%（V/V）接種量轉接至發酵培養基，在28 ℃，150 r/min條件下培養36 h，離心取上清液，加入等體積的乙酸乙酯溶液，充分混勻后對其超聲處理（1 h）。靜置待其分層，吸取上層溶液，加入無水硫酸鈉，靜置4 h過濾得澄清溶液，脫水干燥后加入二氯甲烷復溶，用于GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent VF-WAXms（30m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流量為1.5 mL/min；起始溫度50 ℃保持1 min，以6 ℃/min速率上升到150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min速率上升到250℃，保持7 min。進樣口溫度250 ℃，分流比10∶1；進樣體積1 μL。

質譜條件：EI方式，氣質接口溫度280 ℃，離子源溫度30 ℃，離子化電壓70 eV，掃描范圍35～500 amu，掃描速率1.65 scan/s，溶劑延遲4 min。

圖譜檢索：通過譜庫（NIST05，Wiley275）對所得揮發性成分進行定性，用色譜峰面積歸一化法對各揮發性成分進行定量。

2 結果與分析

2.1 產香酵母的分離鑒定

在菌株分離純化過程中，主要挑選呈現酵母菌落特性（質地均勻、表面濕潤、黏稠、易挑起、較細菌菌落大而厚、乳白色），且培養時散發酵母香氣的菌落。經分子生物學鑒定，從咖啡鮮果、咖啡濕法處理和半干法處理中共篩選到76株酵母，主要為畢赤克魯維酵母（Pichiakluyveri）、異常畢赤酵母（P.anomala）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、矮小假絲酵母（Kazachstaniahumilis）和德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii）。其中，3株酵母的發酵液呈現出濃郁的花果香味，命名為Y03，Y09和Y24。將3株菌的5.8S rRNA序列與NCBI數據庫中的序列進行同源比對，并利用NeighborJoin法構建系統發育進化樹。結果表明，Y03，Y09和Y24分別與K.humilisCh1、K.humilisYMX000387和H.uvarumPMM09-2765L聚于同一個分支，同源性都在99%以上（圖1），初步判定Y03和Y09為K.humilis，Y24為H.uvarum。

圖1 酵母菌株基于5.8S rRNA序列進化樹

2.2 酵母發酵液揮發性成分總離子圖譜分析

咖啡果肉中的糖類成分主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖組成，為評估3株酵母以咖啡果肉為底物進行發酵時所產的揮發性物質，模擬咖啡果肉的糖組成進行后續發酵。3株酵母發酵液揮發性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖2，得到的譜圖與NIST05，Wiley275譜庫檢索及對比分析，用色譜峰面積歸一化法對各揮發性成分進行定量，鑒定出的揮發性成分和相對含量見表1。

表1 3種不同酵母發酵的發酵液揮發性成分

圖2 菌株發酵液揮發性成分總離子流圖

2.3 不同酵母發酵的發酵液揮發性成分定性定量分析

利用數據庫檢索及數據分析，對3株酵母發酵液的揮發性成分進行定性定量。由圖2和表1可知：Y03菌株發酵液經過GC-MS分析，能檢測到的揮發性成分主要有40種，包括醇類（40.25%）、肽類（22.12%）、酮類（11.97%）、含硫化合物（9.60%）、酯類（8.76%）、其他化合物（2.84%）、糖類（2.07%）、胺類（1.09%）、酚類（0.83%）、雜環類（0.29%）、烷烴類（0.1%）、酸類（0.08%）；相對含量較高的物質為苯乙醇、2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、對羥基苯乙醇、苯乙酸，4-十四酯、乙酸苯乙酯、呋喃酮、異戊酸香葉酯，分別占35.65%，4.38%，4.26%，2.01%，1.17%，0.69%和0.61%。Y09菌株發酵液能檢測到的揮發性成分主要有35種，包括醇類（38.89%）、肽類（18.47%）、酮類（11.13%）、胺類（10.48%）、酯類（8.67%）、其他化合物（4.00%）、醚類（2.49%）、糖類（1.58%）、吡喃（1.23%）、烷烴類（1.05%）、苯（0.98%）、酚類（0.86%）、醛類（0.17%）；相對含量較高的物質為苯乙醇、六氫吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、對羥基苯乙醇、苯乙酸，4-十四酯、2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸苯乙酯，分別占30.56%，7.07%，4.72%，2.51%，2.10%，1.36%和1.29%。Y24菌株發酵液能檢測到的揮發性成分主要有31種，包括醇類（29.63%）、肽類（28.63%）、酮類（18.17%）、胺類（10.67%）、酯類（3.33%）、其他化合物（2.49%）、醚類（2.27%）、糖類（2.09%）、吡喃（1.12%）、烷烴類（0.70%）、苯（0.60%）、酚類（0.29%）；相對含量較高的物質為苯乙醇、六氫-3-（苯基甲基）吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、六氫吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、對羥基苯乙醇、鄰苯二甲酸二丁酯，分別占14.05%，13.30%，9.96%，3.43%，2.26%和1.86%。因此，3株酵母經發酵后可以產生大量的醇類、酯類和酮類等揮發性物質。

3 討論

為篩選云南小粒咖啡原生產香酵母，試驗對咖啡鮮果、咖啡濕法處理和半干法處理中的酵母進行分離純化，發酵試驗表明菌株Y03，Y09和Y24可以產生濃郁的花果香氣。GC-MS分析結果表明，3株酵母在發酵中可以產生醇類、酯類、酮類和酸類等芳香類物質。酯類化合物大多都具有水果和花香味道，它們的來源主要由脂肪酸和醇類化合物的酯化反應，并且微生物在細胞內可以通過代謝合成酯類化合物，一般是使用高級醇，在乙酰轉移酶作用下合成[9]。酮類化合物大部分都具令人愉快的氣味，在揮發性物質組成上占有重要地位。醇類化合物和水都是極性分子，這些分子都具有羥基這個極性基團，因為氫鍵的作用力會將醇和水分子的排列方式一步一步理順，進而加強醇類化合物的水分子束縛力，降低了醇分子的活度，在味道的感覺上顯現為圓潤柔和，可與香味成分共同協調[10]。進一步分析3株酵母的揮發性成分發現，苯乙醇是玫瑰香氣的無色液體，在我國可當作食用香料使用[11]；異戊酸香葉酯為無色至微黃色液體，帶有濃郁蘋果、菠蘿的果味香氣，并且有玫瑰香；乙酸苯乙酯是無色的油性透明液體，具有玫瑰香氣和蜂蜜香氣，在食品工業中可以用作食用香料[12]；異戊酸是無色黏稠狀液體，稀釋后具有甜的果香，并且還有篤斯越橘的香味，是我國規定可以使用的食用香料[13]；2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮屬于吡喃烯醇酮類化合物，這類具有環狀烯醇酮類的化合物大多具有焦糖樣香味，在味覺上呈現出的“甜味”更加突出[14]。上述化合物不僅有特殊的香氣，其在發酵液中含量也相對較高。因此，篩選出的咖啡原生酵母菌可以產生花果香味物質，在強化云南小粒品質方面有著較大的應用潛力。

4 結論

從咖啡鮮果、咖啡濕法處理和半干法處理中共篩選到76株酵母，其中3株酵母在發酵中產香濃郁。隨后的分子鑒定表明，Y03和Y09菌株為K.humilis，Y24菌株為H.uvarum。GC-MS分析結果表明，3株酵母在發酵過程中可以產生苯乙醇、乙酸苯乙酯、異戊酸等具有花果香氣的醇類、酯類、酸類和酮類物質，下一步可用于云南咖啡發酵，從而彌補小粒咖啡花果香不足的缺陷。