乳雙歧桿菌凍干保護劑的研究及質量評價

竹磊

河南省商業科學研究所有限責任公司（鄭州 450002）

乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）又稱動物雙歧桿菌，是腸道中最典型的有益菌[1-3]，屬于雙歧桿菌屬。典型的菌體形態有V形、Y形和曲狀等，無鞭毛、不運動、無芽孢，對氧非常敏感[4]，主要存在于人類和哺乳動物腸道內，能定植于腸道且發揮益生功效，如調節腸道菌群、抑制有害菌生長[5]、降低膽固醇、增強機體免疫力[6]等。因其獨特的益生功效，被廣泛應用于食品、醫療保健、畜禽養殖等領域[7]。

在乳雙歧桿菌的保存過程中，為防止菌體的衰老和死亡，通常通過去除菌體的水分阻止其新陳代謝，從而保存菌體[8-9]。乳雙歧桿菌菌粉主要通過真空冷凍干燥技術實現，然而冷凍和干燥過程中會使細胞受到損傷、死亡及某些蛋白酶分子鈍化[10-11]。如果菌體直接進行冷凍干燥，存活率很低，但若將菌體懸浮于適宜的介質中再進行冷凍干燥，可使菌體的存活率達到70%以上[12]。因此，選擇合適的凍干保護劑非常必要。保護劑可以改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學環境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[13]，還能保護乳酸菌抵抗不良環境，有效促進有益菌的生長，進而提高凍干粉中益生菌的存活率和保藏期間的細胞穩定性[14]。現有的冷凍干燥保護劑對于乳雙歧桿

菌的活性有一定保護作用，但是在冷凍干燥工藝中活細胞損失較大，并不能很好地保持原有的各種生理生化特性和生物活性[15-16]。因此，為進一步提高乳雙歧桿菌在冷凍及干燥等各種不利環境下的存活率，以乳雙歧桿菌為研究對象，分析不同凍干保護劑對其存活率的影響，研制最佳的復合保護劑配方，并進行穩定性研究，以期提高菌體在冷凍過程中的存活率，為凍干益生菌的開發利用提供理論依據[17]。試驗的凍干保護劑能將細胞和菌體最大面積地包裹在其中，減少細胞組織和菌體與氧氣間接或直接接觸，為細胞提供一個良好的休眠環境，因此能達到延長物料的儲存期，使物料在一定時間內保持較高活性的效果[18]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳雙歧桿菌（ATCC 700541，中國工業微生物菌種保藏管理中心）；MRS培養基（青島海博生物技術有限公司）；菊粉、海藻糖（上海源葉生物科技有限公司）；脫脂乳粉（內蒙古伊利實業集團股份有限公司）；半胱氨酸鹽酸鹽（天津市大茂化學試劑廠）。

YQX-Ⅱ厭氧培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；LRH-550電熱恒溫培養箱（廣東省泰宏君科學儀器股份有限公司）；BKQ-B75L滅菌器（山東博科消毒設備有限公司）；SCIENTZ-30YG/A真空冷凍干燥機（寧波新芝凍干設備有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（濟南愛來寶儀器設備有限公司）；BSC-1500ⅡB2-X生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術有限公司）；DGG-9030A電熱恒溫鼓風干箱（上海昀冠機電設備有限公司）；HH-M6恒溫水浴鍋（江蘇新春蘭科學儀器有限公司）；HZ-9811K恒溫振蕩器（上海佐研儀器科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種擴大培養

將保藏的乳雙歧桿菌（ATCC 700541）融化，取1 mL接種到MRS液體培養基中，在36 ℃靜置培養8～12h，無菌生理鹽水離心洗滌3次，用無菌水將菌懸液調至適宜濃度備用[19]。

1.2.2 離心條件的選擇

將乳雙歧桿菌培養液移入無菌離心管中，分別在4 000，6 000，8 000和10 000 r/min條件下離心10和20min；棄去上清液，收獲菌體，生理鹽水洗滌[20]。

1.2.3 保護劑的制備

取一定量的海藻糖、菊粉、玉米淀粉、半胱氨酸鹽酸鹽、脫脂乳粉溶于無菌水中，其中海藻糖、玉米淀粉、菊粉、脫脂乳粉在121 ℃滅菌20 min。半胱氨酸鹽酸鹽過濾除菌（0.22 μm微孔濾膜）。

1.2.4 單因素試驗

研究采取測定不同菊粉添加量（0，2%，4%，6%和8%）、脫脂乳粉添加量（0，2%，4%，6%，8%和10%）、半胱氨酸鹽酸鹽添加量（0，0.2%，0.4%，0.6%和0.8%）和海藻糖添加量（0，3%，6%，9%和12%）對乳雙歧桿菌存活率的影響。

1.2.5 正交試驗優化復合保護劑配方

根據單因素試驗結果，篩選出對凍干過程中菌體保護效果較好的保護劑。以真空冷凍干燥后菌體存活率為評價指標，通過正交試驗對復合保護劑配方進行優化設計，以得到最佳復合保護劑配方[21]。

1.2.6 真空冷凍干燥

將乳雙歧桿菌放入-80 ℃超低溫冰箱中預凍2 h，預凍時要用保鮮膜將容器口封住，并在保鮮膜上扎一些小洞，經過2 h后取出，放入真空冷凍干燥機內，12h取出即可。測定真空冷凍干燥前后活菌總數，并計算存活率。

1.2.7 熱環境的耐受性研究

取0.5 g真空冷凍干燥后的乳雙歧桿菌，在30，50，60和70 ℃中水浴加熱30 min后，在37 ℃，180r/min的恒溫搖床中振蕩培養2 h。測定乳雙歧桿菌數量。

1.2.8 乳雙歧桿菌的貯存穩定性

將制備好的乳雙歧桿菌于不同溫度條件下貯存，每15 d測1次活菌數，以此考察乳雙歧桿菌的貯存存活率。

1.3 數據處理

采用Excel 2013、正交設計助手Ⅱ V3.1進行統計分析[22]。

2 結果與分析

2.1 離心條件的確定

離心是發酵劑制備過程中的關鍵步驟，因此試驗對離心轉數及時間對收獲細胞濃度的影響進行試驗性分析，具體結果見表1。

表1 離心條件對菌體細胞濃度的影響

表2 正交因素水平表 單位：%

由表1可以看出，離心轉速4 000和6 000 r/min時，由于離心轉速較低，有些小細胞不易被收集，但當離心轉速達到10 000 r/min時，過高的離心轉速和時間容易導致細胞的死亡[23]，使平板計數法測定的活細胞數較低，因此，較適宜的離心收集條件為8 000 r/min、20 min，此時收獲的活細胞數是離心前的96.26%。

2.2 凍干保護劑單因素試驗結果

2.2.1 菊粉添加量對凍干菌體存活率的影響

由圖1可知，菊粉在冷凍干燥時對乳雙歧桿菌起到明顯的保護作用。菊粉添加量2%時，乳雙歧桿菌菌體存活率達到最大值，繼續增大菊粉添加量并不能提高其存活率。

圖1 菊粉添加量對凍干菌體存活率的影響

2.2.2 脫脂乳粉添加量對凍干菌體存活率的影響

由圖2可知，脫脂乳粉在冷凍干燥時對乳雙歧桿菌具有明顯保護作用。脫脂乳粉添加量小于6%時，隨著脫脂乳粉的添加量不斷增大，凍干后乳雙歧桿菌的存活率不斷增大，然而當達到6%后，脫脂乳粉的保護作用已達到最大，再增大其添加量，存活率也不會繼續增加。

圖2 脫脂乳粉添加量對凍干菌體存活率的影響

2.2.3 半胱氨酸鹽酸鹽添加量對凍干菌體存活率的影響

從圖3可看出，當半胱氨酸鹽酸鹽添加量在一定范圍內時，隨著添加量的增大，凍干后菌體的存活率也隨之提高。半胱氨酸鹽酸鹽添加量達到0.6%時，菌體存活率最高。半胱氨酸鹽酸鹽添加量繼續增大，凍干后菌體的存活率反而有所下降。綜上可得，半胱氨酸鹽酸鹽的最佳添加量為0.6%。

圖3 半胱氨酸鹽酸鹽添加量對凍干菌體存活率的影響

2.2.4 海藻糖添加量對凍干菌體存活率的影響

由圖4可知，海藻糖在冷凍干燥時對乳雙歧桿菌起到明顯保護作用。隨著海藻糖添加量不斷增大，菌體存活率增大，但當海藻糖添加量大于9%時，凍干菌體存活率降低。分析原因可能是，當海藻糖添加量較小時，隨著添加量的增加[24]，海藻糖所形成的玻璃態越來越穩固，對菌體的保護作用也越來越大；但海藻糖添加量過高時，會加速細胞內蛋白質的聚合，不利于細胞的低溫保存，從而導致菌體存活率出現下降現象。

圖4 海藻糖添加量對凍干菌體存活率的影響

2.3 正交試驗優化復合保護劑配方

根據單因素試驗結果，以菌體存活率作為評價指標進行正交試驗[25]。

利用直觀分析法觀察正交試驗結果，從表3可以看出，影響菌體存活率的因素主次順序是B（脫脂乳粉添加量）＞D（海藻糖添加量）＞A（菊粉添加量）＞C（半胱氨酸鹽酸鹽添加量）。即脫脂乳粉為最重要影響因素。同時可以確定復合凍干保護劑的最佳配方為A1B2C3D2，即菊粉2%、脫脂乳粉6%、半胱氨酸鹽酸鹽0.6%、海藻糖9%。

表3 正交試驗方案結果表

表4 不同溫度和時間下的乳雙歧桿菌活菌數單位：CFU/g

2.4 驗證試驗

驗證試驗共進行3次，經真空冷凍干燥處理后，測得的菌體存活率分別為83.2%，83.9%和84.1%，平均值為83.8%，與預期結果基本一致。

2.5 熱穩定性研究

加熱處理是食品加工過程中常見的方式。然而益生菌在高溫下存活率較低，導致其在食品中的應用受到限制。將凍干乳雙歧桿菌（含保護劑）、凍干乳雙歧桿菌（不含保護劑），置于30，40，50，60和70 ℃進行水浴加熱30 min，研究熱處理對乳雙歧桿菌活力的影響，結果如圖5所示。50 ℃加熱處理后，菌體存活率差別并不明顯。溫度升高到60 ℃時，凍干乳雙歧桿菌（含保護劑）存活率為75%和72%，而凍干乳雙歧桿菌（不含保護劑）存活率為50%，表明凍干保護劑在熱環境下對乳雙歧桿菌有明顯的保護效果，而不加保護劑直接凍干對菌體損傷較大，存活率較低。溫度達到70 ℃時，與凍干乳雙歧桿菌（不含保護劑）存活率相比，凍干乳雙歧桿菌（含保護劑）的存活率較高（62%），進一步說明凍干保護劑能顯著提高乳雙歧桿菌在熱處理條件下的生存能力，增強其耐熱性。

圖5 熱處理對乳雙歧桿菌活力的影響

2.6 不同溫度和時間下的貯存穩定性

隨著貯存時間的延長，乳雙歧桿菌的活菌數逐漸下降。溫度的不同對乳雙歧桿菌的存活率也有一定影響[26]。其中，在-20 ℃條件下貯存乳雙歧桿菌活菌數最高，貯存60 d后活菌數仍達6.78×109CFU/g。在4 ℃條件下貯存的乳雙歧桿菌也具有很好的穩定性。而在20和37 ℃條件下貯存的乳雙歧桿菌隨著時間的延長，活菌數較-20和4 ℃下降快。由此可見，20和37 ℃條件下不利于貯存乳雙歧桿菌。因此，選擇-20 ℃條件下貯存乳雙歧桿菌。

3 結論與討論

益生菌產品面臨的主要問題就是在制作、保存和應用過程中活菌數變少，存活率太低，達不到能發揮保健作用的最低劑量，導致益生菌的功效大打折扣。試驗制備的凍干用復合保護劑采用多種活性組分，不添加任何化學合成物質，安全性高；提高乳雙歧桿菌菌體存活率；后期穩定，能在常溫下保持較高的存活率。乳雙歧桿菌復合凍干保護劑最佳配方為菊粉2%，脫脂乳粉6%，半胱氨酸鹽酸鹽0.6%，海藻糖9%。對其冷凍干燥后，平均存活率可達83.8%。70 ℃條件下處理30 min，凍干乳雙歧桿菌存活率達62%。添加凍干保護劑后明顯提高乳雙歧桿菌的熱穩定性。在-20，4，20和37 ℃貯存60 d后，活菌數仍達109CFU/mL以上。因此，試驗制備的凍干保護劑能提高乳雙歧桿菌的存活率和穩定性，從而延長貨架期。