基于LF-NMR和3D-SFS的植物糖漿摻假蜂蜜快速鑒別技術

李旺旺，李琳琳，梁斌，汪旭海，李恒明，龍門*

1. 生物與食品工程學院滁州學院（滁州 239000）；2. 安徽泓順源生物科技有限公司（滁州 239000）

市場上蜂蜜種類繁多，但消費者對蜂蜜產品的辨識度不夠，許多不法分子為牟取暴利，通過摻雜使假等手段制作假蜂蜜[1]。蜂蜜是以果糖和葡萄糖為主的多糖類物質，其含量占蜂蜜的70%～80%[2]，因此在蜂蜜中混入類似的糖類物質是常見的摻假手段。最初是在蜂蜜中摻入白糖水[3]，但此種摻假手段易被感官技術和理化檢測辨別出來，現在最常見的是在蜂蜜中摻入高果糖漿、淀粉糖漿等[4]。摻入糖漿的蜂蜜成分雖然與天然蜂蜜成分類似，但其營養價值截然不同，且消費者食用后，造成血糖升高可引發糖尿病、體重增加、血脂水平增加等[5]。我國國家標準規定，不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉類、糖類或代糖類物質[6]。

現階段，常采用感官檢驗法[7]、花粉分析法[8]和理化指標測試法[9-11]進行蜂蜜品質分析。其中：感官檢驗法需要檢測人員擁有豐富的經驗，且存在一定主觀性；花粉分析法雖操作簡單、耗時短、成本低，受外界環境影響大，存在較大不確定性，只能作為判斷蜂蜜真偽的初篩手段；理化檢測耗時長、過程繁瑣、人為誤差大。近年來，隨著儀器分析的發展，有學者使用不同檢測技術對蜂蜜品質進行控制，以期規范蜂蜜市場秩序，主要包括液相色譜質譜法[12-14]、氣相色譜法[15-16]、電子舌法[17]、穩定同位素技術[18]和光譜法[19-20]，但這些檢測方法只在一定范圍內適用，并且面對不斷提升的造假摻假技術，實際使用中更難以滿足市場監管需求。

低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術是利用不同物質的弛豫時間不同，同一物質處于不同相態的弛豫時間也有區別以分辨不同物質，是一種無損、快速的檢測方法，被廣泛應用于食品安全檢測領域[21]。彭丹等[22]采用低場核磁共振技術結合化學計量學，分別利用聚類分析和支持向量機對花生油摻入大豆油（玉米油）進行鑒別，結果表明支持向量機相比于聚類分析可更好地實現對花生油真偽的鑒別，該模型對摻偽花生油的正確識別率為100%；張美軍[23]通過低場核磁共振技術對不同產區五味子進行自旋回波衰減信號（carr purcell meiboom gill sequence，CPMG）分析，結合最小二乘回歸法交叉驗證確定建立五味子樣品合適的水分與揮發油含量預測模型，從而實現五味子不同產地來源的區分；蓋圣美等[24]利用低場核磁共振及磁共振成像技術實現對注水肉糜的快速鑒別。

熒光光譜分析技術的原理是利用樣品中熒光物質產生熒光效應，這些熒光物質可以是源自于食品樣品內部，即由樣品自身成分產生熒光效應，被稱為內源性熒光物質（autofluorescence）[25]。蜂蜜含有大量的熒光團，如多酚、少量蛋白質、肽、氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）[26-27]。這些熒光物質可以在一定的激發波長范圍內發出熒光。因此，熒光光譜法適用于鑒定蜂蜜的真實性。試驗以純油菜蜜為研究對象，利用LF-NMR技術和三維同步熒光技術（threedimensional total synchronous fluorescence spectroscopy，3D-SFS）結合化學計量學方法對摻假比例0～100%的油菜蜜進行檢測，通過神經網絡建立蜂蜜摻假判別模型，實現對糖漿摻假油菜蜜的有效識別，為蜂蜜的鑒別和質量監控提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

純油菜蜜（產地分別為江蘇、內蒙古呼倫貝爾市海拉爾區安徽、四川，安徽泓順源生物科技有限公司）；麥芽糖漿80B、果葡糖漿F60、全蔗糖糖漿（廣西梧州樂哈哈食品工業有限公司）；3D-SFS檢測時使用1 cm×1 cm石英比色皿。

1.2 主要儀器與設備

MesoMR23-060V-I核磁共振分析儀（上海紐邁電子科技有限公司）；Cary Eclipse型熒光分光光度計（美國安捷倫科技公司）；PL203型電子天平（英國梅特勒-托利多儀器有限公司）；HHS-11-4電熱恒溫水浴鍋（常州恒隆儀器有限公司）；HYQ-3111渦旋混勻器（上海珂淮儀器有限公司）；DHG-9101-OSA型電熱恒溫鼓風干燥箱（江蘇盛藍儀器制造有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 樣品制備

將3種糖漿與4個產地油菜蜜按照不同比例進行混合設置試驗組。糖漿與蜂蜜的總質量固定為10 g，摻假比例按照0～100%進行設置，糖漿增量5%，共設置21個梯度；稱取目標梯度的蜂蜜，按照摻假比例再稱取對應質量的糖漿混合，使用渦旋混勻器以300 r/min轉速混勻1 min，使糖漿與蜂蜜充分混合，置于45 ℃恒溫水浴鍋中45 min去除水泡，形成由3個純植物糖漿樣品、4個純蜂蜜樣品、19×12個摻假蜂蜜樣品組成的235個樣品，形成樣品組。

1.3.2 蜂蜜水分檢測

將稱量瓶洗凈烘干，稱量其質量，記為m1，往稱量瓶中加入5 g海砂，將其置于105 ℃恒溫干燥箱中干燥1 h，取出后將其置于放有有效干燥劑的干燥器內冷卻0.5 h，稱量其質量，重復干燥及冷卻操作直至稱量結果恒重（前后2次質量差不超過0.000 2 g）。向稱量好海砂的稱量瓶中稱取2 g（稱量結果精確至0.000 1g）樣品，記為m2。輕微搖動稱量瓶使樣品與海砂充分混勻。混勻后置于沸水浴上蒸干。蒸干后置于105℃恒溫干燥箱中4 h。取出后置于放有有效干燥劑的干燥器中冷卻0.5 h，取出后對其質量進行稱量，稱量完成后置于恒溫干燥箱中干燥1 h，干燥結束后取出，置于干燥器中冷卻0.5 h，對其質量再次進行稱量，若前后稱量結果不超過0.000 2 g則達到恒重，若未能達到恒重，則重復干燥及冷卻操作直至其達到恒重，最后一次的稱量結果記為m3。樣品水分按式（1）計算。

式中：M為樣品水分，g/100 g；m1為稱量瓶質量，g；m2為稱量瓶（含海砂）質量與樣品干燥前質量，g；m3為稱量瓶（含海砂）質量與樣品干燥后質量，g。

1.3.3 LF-NMR檢測

樣品的預處理：將235個摻假蜂蜜樣品從冰箱中取出，置于45 ℃恒溫水浴鍋中恒溫加熱45 min。

核磁共振分析儀的參數設置：序列設置為QCPMG，譜寬（SW）100，中心頻率416 796.321 Hz，測試溫度32 ℃，脈沖寬度（p1）11 μs，延遲時間（d1）1 s，掃描次數（ns）8。

1.3.4 3D-SFS檢測

掃描模式設置為同步模式，數據模式為熒光，激發波長200 nm，起始波長250 nm，終止波長850 nm，激發狹縫5 nm，發射狹縫5 nm，激發終止波長750nm，激發波長增量5 nm，掃描速度中等。

2 結果與分析

2.1 糖漿摻入比例與蜂蜜水分的關系

由圖1～圖3可以看出：四川、海拉爾與安徽3個產地油菜蜜摻假樣品的水分與蔗糖糖漿的摻入比例存在明顯線性關系，3個產地的油菜蜜摻假樣品的水分均隨著蔗糖糖漿摻入比例的增加而增加，而江蘇產地的油菜蜜摻假樣品與蔗糖糖漿的摻入比例并不存在明顯線性關系；摻入麥芽糖漿的油菜蜜樣品的水分與摻入比例均存在明顯線性關系，4個產地油菜蜜摻假樣品的水分隨著麥芽糖漿摻入比例的提高而下降，同時表明麥芽糖漿導致的這種趨勢走向與油菜蜜的來源地之間無明顯關系；四川與海拉爾2個產地油菜蜜的水分與摻入果葡糖漿的比例無線性關系，而江蘇與安徽產地油菜蜜的水分與摻入果葡糖漿的比例表現出弱正相關關系，隨著果葡糖漿摻入比例的提高，這2個產地油菜蜜摻假樣品的水分增加，說明果葡糖漿的摻入量是影響江蘇與安徽2個產地油菜蜜水分的因素但不是主要影響因素。

圖1 4個產地油菜蜜的水分與蔗糖糖漿比例的線性關系圖

圖2 4個產地油菜蜜的水分與麥芽糖漿比例的線性關系圖

圖3 4個產地油菜蜜的水分與果葡糖漿比例的線性關系圖

2.2 LF-NMR采集的樣品數據分析

采用Levenberg-Marquardt，選取160個摻假蜂蜜樣品作為訓練集，34個摻假蜂蜜樣品作為驗證集，34個摻假蜂蜜樣品作為測試集，隱含神經元數量默認為10，經訓練得到圖4。訓練集、驗證集、測試集及綜合集的R值分別為0.799 24，0.367 57，0.396 236與0.691 8，R值越接近1說明擬合程度越好，從綜合訓練結果圖來看，訓練集、驗證集、測試集與綜合集的數據的擬合效果都差強人意，因此此模型不適合用作判別摻入植物糖漿的蜂蜜。

圖4 核磁共振測數據所做的蜂蜜摻假判別模型圖

2.3 3D-SFS樣品數據分析

2.3.1 特征發射波長差Δλ的選取

通過對3種純糖漿、4個產地純蜂蜜與4個產地摻入3種糖漿50%比例的蜂蜜的三維同步熒光圖發現，發射波長差Δλ=80 nm時，其熒光強度變化差異最大。根據圖5可以發現，在激發波長Ex=250～450 nm附近的熒光強度（R.U）變化差異非常明顯，說明樣品中熒光物質的差異在此處最為明顯。

圖5 發射波長差Δλ=80 nm時安徽、江蘇、海拉爾與四川4種產地的油菜蜜與麥芽、蔗糖與果葡3種糖漿的熒光強度變化圖

2.3.2 主成分分析

根據選取的特征發射波長Δλ=80 nm對3種純糖漿與4種純蜂蜜樣品的三維同步熒光數據在此波長時的數據進行主成分分析，得到圖6，提取的第一主成分、第二主成分與第三主成分對數據的信息描述分別為75.67%，19.72%與4.13%，三者累加的數據信息表述量為99.52%，說明3個主成分包含原數據的99.52%。蜂蜜與糖漿之間可以明顯區分開，4種蜂蜜聚集在一起而3種糖漿則分散開，說明所選擇的發射波長差Δλ=80 nm可作為用于判別摻入植物糖漿的蜂蜜的特征發射波長。

圖6 3種純糖漿與4種純蜂蜜樣品的三維同步熒光主成分分析圖

2.3.3 利用神經網絡建立蜂蜜摻假判別模型

數據的訓練算法采用Levenberg-Marquardt，選取160個摻假蜂蜜樣品作為訓練集，34個摻假蜂蜜樣品作為驗證集，34個摻假蜂蜜樣品作為測試集，隱含神經元數量默認為10，經訓練得到圖7。訓練集、驗證集、測試集及綜合集的R值分別為1，0.946 54，0.974 86與0.946 54，R值越接近1說明，擬合程度越好，綜合訓練結果圖來看，訓練集、驗證集、測試集與綜合集對數據的擬合效果較好，因此模型可用作判別摻入植物糖漿的蜂蜜。

圖7 三維同步熒光檢測數據所做的蜂蜜摻假判別模型圖

3 結論

通過建立散點圖分析油菜蜜摻假樣品與植物糖漿摻入量的關系發現，麥芽糖漿的水分與油菜蜜的水分有著明顯差異，且麥芽糖漿在蜂蜜中的摻入量與油菜蜜的水分變化呈現一定的線性關系，且這種線性變化趨勢受蜂蜜的來源地影響很小，因此在檢測摻入麥芽糖漿的蜂蜜時可將水分作為一個有效的檢測指標。摻入蔗糖糖漿的油菜蜜的水分與糖漿摻入量之間的關系受到蜂蜜來源地的影響，無明顯線性關系。摻入果葡糖漿油菜蜜的水分與糖漿摻入量之間無線性關系，其水分受其他因素的影響。因此，鑒別摻入植物糖漿的蜂蜜時，水分只能作為參考指標，準確鑒定則需依靠其他有效的鑒別方法。

對蜂蜜和摻假蜂蜜（植物糖漿+油菜蜜）的LFNMR和3D-SFS采集數據進行分析，結合化學計量學探索區植物糖漿摻假蜂蜜可行性。從LF-NMR數據建立的模型擬合結果來看，該模型的適用性不強。從3D-SFS的數據建立的模型擬合結果來看，其在識別摻入植物糖漿蜂蜜時適用性好。摻入植物糖漿后，油菜蜂蜜的熒光物質強度變化有明顯規律，在發射波長Δλ=80 nm，激發波長Ex=250～450 nm時，其變化最為明顯，通過主成分分析對此特征發射波長差的適用性做了進一步驗證，綜上所述3D-SFS可簡單、快速地用于未知蜂蜜的植物糖漿摻假鑒別，為規范蜂蜜市場提供有利依據。