HPLC-MS/MS技術(shù)同時(shí)測定雞蛋中5種抗球蟲藥

王穎怡，吳玉田，孟春楊，周貽兵，劉利亞

貴州省疾病預(yù)防控制中心（貴陽 550004）

球蟲是一種寄生孢子蟲，可寄生于畜、禽腸道壁細(xì)胞[1]。其可宿主動物包括家禽如豬、兔、羊、牛及其他動物[2-4]。球蟲病是家禽中最為常見且侵害性最強(qiáng)的一種寄生蟲病，通常是由一種或多種球蟲引起的急性流行性疾病。雛雞或青年雞的發(fā)病率和致死率可達(dá)80%，成年雞一般不發(fā)病，但若攜帶球蟲，其增重和產(chǎn)蛋能力降低。球蟲繁殖力極強(qiáng)，當(dāng)家禽受急性感染時(shí)，得不到及時(shí)治療，死亡率會大幅上升。長期以來，球蟲病的防治主要依賴抗球蟲藥物，全球每年用于防治球蟲病的藥物費(fèi)用達(dá)3.2億美元，然而由于球蟲能夠?qū)缀跛锌骨蛳x藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物的防治效果較低甚至失效，因此增加用藥劑量或者延長用藥時(shí)間，可能造成在家禽體內(nèi)的藥物殘留[5]，通過食物鏈的傳遞，進(jìn)而危害消費(fèi)者健康。

抗球蟲藥物的主要檢測方法包括分光光度法、微生物法、色譜法等[6]，其前處理技術(shù)主要包括固相萃取凈化[7]及QuEchERs凈化技術(shù)[8]。經(jīng)典的固相萃取方法雖然重現(xiàn)性穩(wěn)定，但樣品前處理步驟繁瑣、成本較高，對操作者能力要求更高，而QuEchERs凈化技術(shù)操作簡便，處理過程簡單，更適合大批量樣品的快速篩查工作。因此，基于QuEchERs凈化技術(shù)，建立雞蛋中5種抗球蟲藥物HPLC-MS/MS殘留確證分析方法，對隨機(jī)抽取的33個(gè)批次市售雞蛋進(jìn)行分析，為抗球蟲藥物殘留監(jiān)管、風(fēng)險(xiǎn)評估提供參考，對確保動物源性食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290型超高效液相色譜儀、Agilent 6470型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；3-30KS型高速離心機(jī)（德國賽多利斯公司）；Milli-Q型超純水機(jī)（美國密理博公司）；IKA MS3型渦旋混勻器（德國IKA公司）；T 460 H型超聲波清洗器（北京博勵(lì)行儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亞砜、甲醇中托曲珠利-d3標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙腈、甲醇（美國飛世爾試劑公司）；CNWBOND PSA、CNWBOND HCC18填料（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Agilent Bond Elut QuEChERS dSPE EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管[安捷倫科技（上海）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

分別準(zhǔn)確稱取地克珠利、尼卡巴嗪、托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亞砜于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，其中尼卡巴嗪及地克珠利用乙腈定容，吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制成質(zhì)量濃度100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)使用液，在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.1.2 甲醇中托曲珠利-d3（內(nèi)標(biāo)）儲備溶液

準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL甲醇中托曲珠利-d3標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的托曲珠利-d3標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.3.2 前處理方法

稱取2 g均質(zhì)試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入2 mL水渦旋混勻，加入10 mL乙腈，漩渦混合30 s，超聲提取20 min。按10 000 r/min離心10 min（溫度低于5 ℃）。上清液待轉(zhuǎn)出。另取一15 mL離心管，加入250 mg HC-C18、50 mg PSA吸附劑和2 g無水硫酸鈉，移入6 mL上述上清液，振蕩1 min；按9 000 r/min離心5 min，移取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（RRHD，2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇溶液；流速0.3 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源模式：電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-）。儀器參數(shù)：毛細(xì)管電壓3 500 V，鞘氣溫度250 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，噴霧器35 psi，鞘氣流速11 L/min；采集模式采用多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式，化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件與選擇

由于5種化合物均屬于中等或弱極性物質(zhì)，在水中的溶解度較低，根據(jù)相似相溶原則，分別考察乙腈、甲醇、酸化的乙腈溶液（含0.1%甲酸）及酸化的甲醇溶液含（0.1%甲酸）在雞蛋中的提取效果。與甲醇溶液相比，乙腈溶液滲透性強(qiáng)，且具有較好沉淀蛋白的凈化效果。經(jīng)甲醇溶液提取的樣品雜質(zhì)較多，干擾對目標(biāo)物的分析檢測，而含0.1%甲酸的乙腈提取溶液可改善樣品中目標(biāo)分析物峰形，該混合溶劑既能有效提取樣品中5種目標(biāo)分析物，又能高效率沉淀蛋白，降低雜質(zhì)干擾，最終選擇含0.1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化劑的優(yōu)化

QuEChERS方法與傳統(tǒng)的固相萃取等方法相比具有快速、高效、成本低等優(yōu)勢，是動物源性食品中藥物殘留分析領(lǐng)域較為簡便、快速的方法[9]。Agilent Bond Elut QuEChERS dSPE EMR-Lipid作為新型的脂質(zhì)去除產(chǎn)品，首次被應(yīng)用于QuEChERS方法，具有高選擇性去除樣品中脂類物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，因此首先考察EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管在雞蛋中的凈化提取效果，尼卡巴嗪在檢測過程中，EMR-Lipid凈化管去除雜質(zhì)效果不佳，抑制效應(yīng)明顯，回收率較低。此外，托曲珠利砜經(jīng)PSA凈化后無回收率，因此上述2種方法不適用于分析物的同時(shí)檢測。選擇合適的吸附劑類型是解決問題的關(guān)鍵，常用凈化材料有PSA、C18、GCB等，PSA可有效吸附酚類、糖類、色素、有機(jī)酸，C18可吸附脂肪、脂類和一些礦物質(zhì)等，GCB可去除色素和少量非極性干擾物[11]。由于雞蛋中含有脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，因此實(shí)驗(yàn)將C18與PSA混合作為吸附劑，對PSA和C18凈化材料設(shè)置不同比例進(jìn)行試驗(yàn)，對比相關(guān)比例及相應(yīng)的回收率情況見圖1。結(jié)果表明，C18250 mg、PSA 50 mg時(shí)，去除雜質(zhì)效果更好，回收率較高，大多集中在80%～110%范圍內(nèi)。最終選擇C18250 mg、PSA 50 mg為吸附劑的改良分散固相萃取法對樣品進(jìn)行凈化。

圖1 不同吸附劑對目標(biāo)分析物回收率的影響

2.3 流動相的選擇

分別考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液等不同洗脫體系對目標(biāo)物分離能力。結(jié)果表明，使用甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相時(shí)，目標(biāo)物有良好的色譜分離效果，色譜峰峰型更好，且有較好的響應(yīng)值，在試驗(yàn)條件下，5種抗球蟲藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)液中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亞砜及托曲珠利-d3的MRM色譜圖見圖2。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖及提取離子色譜圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的存在對分析儀器產(chǎn)生嚴(yán)重污染，目標(biāo)物除外的其余成分影響其離子化效率，從而造成抑制或增強(qiáng)組分的信號響應(yīng)，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。由于雞蛋中富含蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，因此沿用由Matuszewski等[16]首次提出的析基質(zhì)效應(yīng)評估方法，即提取后添加法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的考察，根據(jù)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行評估。

基質(zhì)效應(yīng)（ME）=Y/X×100% （1）

式中：Y為空白樣品基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)品的平均響應(yīng)值；X為純?nèi)軇┲屑尤胂嗤磕繕?biāo)物的平均響應(yīng)值。

結(jié)果表明，托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亞砜、地克珠利、尼卡巴嗪的峰面積比值分別為78%，80%，80%，75%和96%。比值越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果影響越小；比值大于100%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；比值小于100%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)[13-16]。因此為減少基質(zhì)效應(yīng)對定量的影響，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5 線性范圍、檢出限、定量限

采用基質(zhì)提取液配制一系列不同濃度的5種抗球蟲藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化好的色譜條件、質(zhì)譜條件下依次進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法定量。以目標(biāo)分析物定量離子對與內(nèi)標(biāo)物定量離子對的峰面積之比為縱坐標(biāo)，樣品中目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。同時(shí)，試驗(yàn)采用在用空白樣品加入低質(zhì)量濃度的抗球蟲藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)上述方法處理測定，以響應(yīng)值的3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。由表3可知，5種目標(biāo)分析物線性關(guān)系良好（R2＞0.99）。

表3 方法線性回歸方程與定量限、檢出限

2.6 準(zhǔn)確度及精密度

分別對空白雞蛋樣品中進(jìn)行3個(gè)不同水平的加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測定6次，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表4可知，5種化合物在0.6，3.0和6.0 μg/kg 加標(biāo)水平的回收率為79.5%～99.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為3.2%～10.5%，表明該方法重復(fù)性良好，可滿足實(shí)際檢測的需要。

表4 方法的回收率和精密度（n=6）

2.7 實(shí)際樣品的檢測

對隨機(jī)抽取的33個(gè)批次市售雞蛋進(jìn)行分析，其中托曲珠利砜檢出1批次，檢出率為3.0%，含量為58.0 μg/kg，超過GB 31650.1——2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中41種獸藥最大殘留限量》規(guī)定的托曲珠利在禽蛋中限量標(biāo)準(zhǔn)，即10 μg/kg（以殘留標(biāo)志物托曲珠利砜含量計(jì)），反映出在生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，或出現(xiàn)抗球蟲藥物使用不規(guī)范，用藥劑量較大，產(chǎn)蛋期未休藥或休藥不及時(shí)的現(xiàn)象，因此對人體健康存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

建立雞蛋樣品中5種抗球蟲藥的QuEchER凈化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。通過對提取劑、流動相等條件進(jìn)行優(yōu)化，對EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管及不同凈化劑凈化效果進(jìn)行評估，采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法具有操作簡便、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于禽蛋中5種殘留抗球蟲藥物的篩查與監(jiān)測。