4種消除高粱直鏈淀粉測定中支鏈淀粉干擾的方法比較

卜慶狀，鄒雪梅，郝曉莉，詹德江

遼寧省農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所（沈陽 100161）

淀粉是高粱的主要營養成分之一，占高粱籽?？墒秤貌糠?0%～80%[1-2]。高粱淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其含量高低及比例對高粱口感、釀造品質和出酒率具有重要影響，同時也是高粱糯性的評價指標之一[3-6]。因此，準確測定高粱中淀粉含量對于高粱的食用、加工及品質評價具有重要意義。

目前，主流的測定方法仍然是基于碘離子與直、支鏈淀粉生成顯色反應物的分光光度比色法[7]。該方法操作簡便、儀器及試劑門檻較低，是標準中最常采用的方法[8]?；诖嗽淼臏y定方法被廣泛應用在谷物直鏈淀粉含量測定上，但是支鏈淀粉能與碘結合形成紫色絡合物，會對直鏈淀粉的測定造成干擾，引起測定誤差[9]。因此研究如何消除干擾成為了高粱直鏈淀粉測定過程中亟需解決的問題之一。近年來，多采用混標單波長[10-11]或雙波長法[12-13]多用來測定直鏈淀粉含量。三波長分光光度法最顯著的特征就是消除非目標物的干擾，在食品方面多應用于測定黃酮[14-15]和齊墩果酸[16]等活性物質上。上述方法在消除支鏈淀粉干擾方面缺少數據支撐和橫向比較。因此，文章選取了高粱源支鏈淀粉純品作為干擾，根據分光光度計全掃描譜圖，確立了4種直鏈淀粉測定方法，以期最大程度降低支鏈淀粉干擾，建立高粱直鏈淀粉測定方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

材料：7份直鏈淀粉含量不同的商品高粱，其中樣品2和3為糯高粱。

試劑：直鏈淀粉純品（馬鈴薯源，純度97.10%）和支鏈淀粉純品（高粱源，純度78.67%）：農業農村部谷物及制品質檢中心（哈爾濱）；碘、碘化鉀、氫氧化鈉、95%乙醇、冰乙酸、石油醚（沸程30～60℃）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

UV-2550紫外可見分光光度計[島津企業管理（中國）有限公司]；HH-8數顯恒溫水浴鍋（常州榮華儀器制造有限公司）；XS64萬分之一電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液制備

分別稱取0.103 0 g直鏈淀粉純品和0.127 1 g支鏈淀粉純品（按100%折算后結果）于150 mL三角瓶中，加入1 mL體積分數為95%乙醇潤濕粉末，再加入9 mL 1 mol/L NaOH輕輕搖晃使粉末分散，沸水浴加熱10min后迅速冷卻，移入100 mL容量瓶中用水定容，得到1 mg/mL的直鏈淀粉和支鏈淀粉標準溶液。

1.3.2 樣品制備

準確稱取經0.050 g過索式提取法脫脂的0.25 mm高粱樣品粉末于150 mL三角瓶中，加入0.5 mL體積分數為95%乙醇潤濕粉末，再加入1 mL 1 mol/L NaOH輕輕搖晃使粉末分散，沸水浴加熱10 min后迅速冷卻，移入50 mL容量瓶中用水定容，準確吸取2.50 mL定容液于50 mL容量瓶中，加適量水，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘試劑，用水定容，搖勻，顯色30 min后測定。

1.3.3 標準曲線繪制

直鏈淀粉標準液的配制：分別取0.1，0.3，0.5，0.7和1.0 mL直鏈淀粉標準工作液于50 mL容量瓶，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘試劑，用蒸餾水定容，按根據樣品制備過程，工作曲線按百分制計算為4%，12%，20%，28%和40%。室溫靜置30min后搖勻，待用。

支鏈淀粉標準液的配制：分別取0.75，1.05，1.25，1.45和1.65 mL支鏈淀粉標準工作液于50 mL容量瓶，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘試劑，根據樣品制備過程，工作曲線按百分制計算為30%，42%，50%，58%和66%。室溫靜置30 min后搖勻，待用。

混合標準液的配制：設定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量總和為70%，按計算公式推算出直、支鏈淀粉標準工作液用量，混合于50 mL容量瓶中，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘試劑，用蒸餾水定容，根據樣品制備過程，工作曲線按百分制計算（以直鏈淀粉含量計）為4%直+66%支，12%直+58%支，20%直+50%支，28%直+42%支以及30%直+40%支。室溫靜置30 min后搖勻，待用。

1.3.4 測定方法確定

混標單波長法：以特定的直鏈淀粉標準樣品波長為測定波長，按混合標準液繪制標準曲線，以吸光度為縱坐標，混合淀粉中直鏈淀粉含量為橫坐標。

混標雙波長法：以直鏈淀粉標準樣品最大吸收波長為測定波長，通過作圖，在支鏈淀粉上找到參比波長，按混合標準液繪制標準曲線，以混合標準樣品測定波長和參比波長的差值為橫坐標，混合淀粉中直鏈淀粉含量為橫坐標。

混標三波長法：依據三波長原理，按混合標準液繪制標準曲線，在確定的3個波長λ1、λ2、λ3下測定吸光度A1、A2、A3，按公式ΔA=A2-[（λ2-λ1）×A1+（λ3-λ2）×A3]/（λ3-λ1）計算ΔA，以ΔA為縱坐標，混合淀粉中直鏈淀粉含量為橫坐標。

1.3.5 驗證試驗

為了考察和比較各方法對支鏈淀粉與碘顯色反應干擾消除情況，配制10%和20%直鏈淀粉標準溶液并混入不同含量的高粱支鏈淀粉標液，按表1配制成驗證液，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘試劑，用水定容至50 mL，待用。

表1 驗證試驗設計表 單位：%

1.4 數據處理

利用Excel 2020和Origin 8.0作圖，SPSS 22.0對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 直、支鏈淀粉標準樣品全掃描圖

利用直、支鏈淀粉與碘顯色反應原理，采用分光光度計全掃描方式，得到直、支鏈淀粉及混合標樣400～800 nm光譜全掃描圖。如圖1所示，直鏈淀粉在400～800 nm的最大吸收波長位于650 nm處，隨著濃度的不斷升高，650 nm處吸光度呈現上升趨勢，因此可選擇直鏈淀粉全掃描光譜的最大吸收波長作為測定波長。如圖2所示，支鏈淀粉在400～800 nm處最大吸收波長為548 nm。如圖3所示，將直鏈淀粉和支鏈淀粉按照加和為70%的方式混合后發現，混合標樣的最大吸收波長發生了偏折，隨著直鏈淀粉占比不斷加大，最大吸光度不斷接近650 nm，由于支鏈淀粉的加入，在相同直鏈淀粉含量下，混合標樣最大吸收波長處吸光度要明顯高于直鏈淀粉標樣，支鏈淀粉占比越高，兩者差距越明顯，可見支鏈淀粉的干擾不僅在量上明顯，而且還體現在對最大吸收波長的改變上。

圖1 不同含量直鏈淀粉標準樣品全掃描圖

圖2 不同含量支鏈淀粉標準樣品全掃描圖

圖3 不同含量混合標準樣品全掃描圖

2.2 單波長比色法

直鏈淀粉測定時，一般選擇最大吸收波長作為測定波長，因此結合圖1，選擇650 nm處作為測定波長。如圖4所示，在測定過程中發現，700～800 nm相同濃度的直鏈淀粉標樣和混合標樣基本重合，說明在這一波段支鏈淀粉的影響較少。觀察不同濃度支鏈淀粉全掃描圖譜發現，不同濃度支鏈淀粉在740～800 nm處吸光度較低。因此，可選擇740 nm處作為測定波長，此波長處支鏈淀粉的碘顯色反應影響較弱且吸光度較大?；鞓藛尾ㄩL法在650 nm處標準曲線為y=0.015 1x+0.053 3，r=0.999 9；在740 nm處標準曲線為y=0.011 4x-0.004，r=0.999 8。

圖4 直、支及混合標準樣品全掃描疊加圖

2.3 雙波長比色法

配制12%直鏈淀粉標準溶液和58%支鏈淀粉標準溶液，分別在400～800 nm進行全掃描，得到直、支鏈淀粉標準樣品全掃描疊加圖。由圖5可知，直鏈淀粉最大吸收波長為650 nm，根據雙波長法作圖原理，在支鏈淀粉上找到參比波長為432 nm。混標雙波長法標準曲線方程為y=0.013 1x-0.020 8，r=0.999 9。

圖5 雙波長法測定波長確定

圖6 三波長法波長確定

2.4 三波長法比色法

三波長法能有效消除雜質對紫外吸收波長的影響，根據三波長法制圖原理，對直鏈淀粉含量為20%的直鏈淀粉標準樣品進行全掃描，得到所需三個波長，分別為λ1=531 nm、λ2=650 nm、λ3=800 nm，根據公式求得ΔA。混標三波長法標準曲線方程為y=0.017 8x-0.075 3，r=0.996 4。

2.5 驗證試驗

向10%和20%直鏈淀粉中加入不同含量的支鏈淀粉，用以驗證測定方法對支鏈淀粉影響的消除作用。通過圖7可見，方法1采用混標單波長法在650 nm處測定，隨著支鏈淀粉含量增加直鏈淀粉呈現明顯上升趨勢，加標回收率為91.19%～108.18%，平均回收率為99.89%，SRSD為5.98%。雖然混標可以使測定值更接近真實值，但是所測定值隨著支鏈淀粉含量增加直鏈淀粉呈現上升趨勢，可見支鏈淀粉對測定影響較大。方法2在740 nm處測定，結果發現所得數據結果與支鏈淀粉淀粉含量無關，加標回收率為98.25%～104.39%，平均回收率為101.04%，SRSD為3.16%。方法3采用混標雙波長法，加標回收率為98.78%～112.06%，平均回收率為104.80%，SRSD為4.74%。雙波長法所得結果與支鏈淀粉含量無關，測定值略高于真值。方法4為混標三波長法，該方法測定結果與添加值相差較大，不適合直鏈淀粉的測定。綜上所述，方法2和方法3較適合測定高粱中直鏈淀粉含量，可有效消除支鏈淀粉對碘顯色反應的影響。

圖7 不同測定方法比較

2.6 樣品檢測驗證

采用方法2和方法3測定7個高粱樣品，其中Y2和Y3為糯高粱，其余樣品為粳高粱。由表2可知，除Y2和Y3，方法2和方法3差異不顯著。在設定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量加和為70%的體系中，由于隨著支鏈淀粉含量的增加，混標的最大吸收波長出現了左移的現象，糯性高粱直鏈淀粉含量很低，支鏈淀粉含量較高，造成雙波長法出現650 nm處測定值接近或小于432 nm處參比波長情況，兩者差值過小，造成測定誤差加大。

表2 高粱樣品測定結果

3 結論

通過對650 nm處混標單波長（方法一）、740 nm處混標單波長（方法二）、混標雙波長（方法三）和混標三波長（方法三）驗證試驗和加標回收率結果分析，方法二和方法三可準確測定高粱直鏈淀粉含量，并且能夠有效地消除測試過程中支鏈淀粉的干擾。通過測定實際高粱樣品發現，方法二計算簡單，適合高粱直鏈淀粉含量測定，在設定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量加和為70%的體系中，方法三不適合測定低直鏈淀粉的糯性高粱樣品，方法三可開發直鏈淀粉和支鏈淀粉同時測定方法，但要注意混合標中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例。