褪黑素片中兩種功效成分含量測定方法學研究

李軍波，歐陽浩栩，郭丹，李雪峰，郁曉藝

完美（廣東）日用品有限公司（中山 528451）

褪黑素是人類和哺乳動物的腦松果體分泌的神經胺類激素之一，具有改善睡眠質量、克服睡眠障礙的功效[1]。近年來，隨著對褪黑素研究的不斷探索，褪黑素功能的多樣性[2-3]和與其他物質的協同作用被逐漸發現[4-6]，如小劑量褪黑素在維生素B6的參與下，改善睡眠的作用更佳[7-8]。維生素B6又稱吡哆醇，是一種水溶性維生素，為氨基酸、糖及脂類代謝的輔酶[9]。在市場上諸多保健品公司研發了豐富的褪黑素和維生素B6復配產品[10-11]。

對保健品中褪黑素和維生素B6的含量測定中，GB/T 5009.197[12]《保健食品中褪黑素含量的測定》和GB/T 5009.170[13]《保健食品中硫酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、鹽酸、煙酰胺和咖啡因的測定》只能分別檢測褪黑素和維生素B6（以吡哆醇計），但GB/T 5009.197[12]與GB/T 5009.170[13]測試范圍及方法相近，即均適用于保健食品，均用醇類試劑超聲提取，液相色譜紫外測定。現有已報道研究中缺乏對褪黑素片產品中褪黑素和維生素B6檢測的方法的全面研究，為提高檢測效率，此研究擬參考GB/T 5009.170[13]和GB/T 5009.197[12]的前處理方法，提取褪黑素和維生素B6進行試驗研究，建立可同步檢測褪黑素和維生素B6的方法，對建立的方法進行全面的方法學研究，同時參考CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[14]、JJF 1135——2005《化學分析測量不確定度評定》[15]和JJF 1059.1——2012《測量不確定度評定與表示》[16]對建立的方法進行不確定度評價。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

≥99.5%褪黑素（中國計量科學研究）；100%鹽酸吡哆醇（美國Sigma-Aldrich公司）；磷酸、無水甲醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；1-癸烷磺酸鈉（上海安譜公司）。

1.2 主要儀器與設備

1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有可變波長紫外檢測器和Openlab色譜工作站；ML204和ML205電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Elma P180H超聲波清洗器（德國JULABO公司）；Milli-Q去離子水發生器（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：TSK C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：1-癸烷磺酸鈉（1.22 g→850 mL）+乙腈+磷酸=850+150+1；流動相流速：1.0 mL/min；檢測波長：褪黑素222 nm，維生素B6280 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 標準曲線繪制

精密稱取15.44 mg維生素B6（以吡哆醇計）對照品于50 mL容量瓶中，加20 mL水溶解并定容至刻度，搖勻，得254.0 μg/mL的吡哆醇對照品儲備液，備用。精密稱取12.95 mg褪黑素對照品于50 mL容量瓶中，加20 mL體積分數為70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得257.7 μg/mL的對照品儲備液，備用。分別精密吸取10 mL對照品儲備液維生素B6和10 mL對照品儲備液褪黑素，再加入甲醇+水+磷酸=100+400+0.5混合溶液，定容至25 mL，搖勻。分別取0.25，0.5，1，2，3.5和5 mL混合對照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇+水+磷酸=100+400+0.5定容至刻度線，即得系列標準溶液。按照1.3.1小節色譜條件上機測定即為對照品標準曲線。

1.3.3 樣品提取方法

取10片褪黑素片，研細，精密稱定0.5 g（精確至

0.000 1 g），置100 mL量瓶中，加入約80 mL體積分數為70%乙醇溶液超聲提取25 min，每隔5 min振搖1次，冷卻至室溫，加入體積分數為70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻。取5 mL提取液，用水定容至10 mL得稀釋液。取稀釋液過0.45 μm濾膜，取續濾液，即得。

1.3.4 不確定度評定數學模型建立方法

試驗的測量模型按式（1）計算。

式中：X為試樣中褪黑素或維生素B6的含量，mg/g；c為標準測定液中褪黑素或維生素B6的質量濃度，μg/mL；V為試樣的定容體積，mL；f為折算系數，維生素B6以吡哆醇計算折算系數為0.823，褪黑素折算系數為1；m為試樣的稱樣質量，g。

2 結果與分析

2.1 樣品制備方法優化

2.1.1 提取溶劑的優化

現有國標GB/T 5009.197[12]和GB/T 5009.170[13]可分別測定褪黑素和維生素B6，故此方法參考現有國標GB/T 5009.197[12]和GB/T 5009.170[13]，分別使用體積分數為70%乙醇和甲醇+水+磷酸=100+400+0.5提取褪黑素片中的兩種功效成分。選用體積分數為70%乙醇同步提取褪黑素片中褪黑素和維生素B6時，維生素B6色譜峰存在峰分叉的情況如圖1所示。通過調節樣品進樣量和更換不同型號色譜柱仍無法解決維生素B6色譜峰存在峰分叉的問題。當將提取液用水稀釋一倍后維生素B6的分叉峰消失，如圖1所示。為進一步驗證，維生素B6的分叉峰原因，將維生素B6的標樣用體積分數為70%和35%的乙醇分別溶解定容后上機測試，測試結果如圖2所示。

圖1 兩種上機溶液的色譜圖

圖2 兩種溶劑溶解維生素B6的上機色譜圖

圖3 空白對照與樣品色譜圖比較

由圖1和圖2可知，維生素B6的分叉峰消失，可能是維生素B6在體積分數為70%乙醇溶劑中存在溶劑效應，導致色譜峰分叉，該結論與劉麗艷等[17]的研究結論一致。故選擇體積分數為70%的乙醇提取褪黑素片中兩種功效成分，提取時間為25 min，取提取液5 mL，用水定容至10 mL后，取稀釋液過濾后上機測試（前處理方式A）。將該測試結果與使用甲醇+水+磷酸=100+400+0.5提取（前處理方式B），上機測試比對結果進行比對，篩選最佳提取溶劑，比對結果如表1所示。

表1 兩種提取方式的結果對比 單位：mg/g

由表1可知，兩種前處理方式對維生素B6的提取后含量測定相對偏差為0.4%，無明顯差異。而選用甲醇+水+磷酸=100+400+0.5提取，檢測結果較體積分數為70%乙醇提取偏低6.9%。體積分數為70%的乙醇提取褪黑素效果更佳，故選取體積分數為70%乙醇提取樣品后用水稀釋一倍后上機測試，下一步試驗按此條件開展試驗。

2.1.2 提取時間優化

取同一批褪黑素片樣品，分別提取10，25和40 min制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀，計算褪黑素與維生素B6含量，結果見表2。由表2可知，25 min條件下提取褪黑素和維生素B6測定含量最高，提取最充分。故選取25 min為方法驗證的最終提取時間。

表2 不同提取時間的結果對比 單位：mg/g

2.2 方法性能研究結果

2.2.1 系統適用性結果

用色譜數據處理軟件計算褪黑素和維生素B6色譜峰的系統適用性。褪黑素和維生素B6的分離塔板數分別為7 326和13 231均大于5 000，分離度為4.32大于1.5，表明此方法的系統適用性良好。

2.2.2 專屬性考察結果

方法專屬性對照色譜圖如3所示。空白對照溶液色譜圖中未見與供試品溶液、對照品溶液色譜圖中褪黑素和維生素B6相同保留時間的色譜峰，證明陰性無干擾。

2.2.3 線性范圍與定量限結果

按照1.3.1小節條件進行測試，確定各成分的線性范圍（如表3所示）。由表3可知，所得褪黑素片中兩種成分的標準曲線相關系數滿足R＞0.999，兩種成分在各自范圍內均線性良好。各成分的線性范圍均為：褪黑素2.54～50.81 μg/mL，維生素B62.55～50.06 μg/mL，按rSN=10確定各成分的定量限，褪黑素0.05 μg/mL，維生素B60.05 μg/mL。

表3 2種成分的標準曲線、線性范圍及定量限情況

2.2.4 準確度結果

通過對樣品的加標回收試驗考察此方法的準確度，取適量微晶纖維素粉末，加入適量的混合對照品，混合均勻制備成片劑。取20片制備好的加標樣品，按照最優提取，重復制備7份樣品，參考最優的色譜條件進樣分析，計算各對照品的加標回收率。各對照品的加標回收率在95%～105%直徑，滿足GB/T 27417——2017[18]《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》的要求，表明該方法的準確度高，檢測結果準確。具體數據詳見表4。

表4 加標回收試驗結果

2.2.5 精密度結果

通過對同一批次樣品，按照最優提取，重復制備10份樣品，參考最優色譜條件進樣分析，通過標準曲線分別計算2種功效成分的SRSD（n=10），SRSD值均小于5%，表明該方法的重復性好，精密度高。具體數據詳見表5。

表5 精密度試驗結果

中間精密度考察，選取褪黑素片，由試驗員A和B分別獨立開展6次平行試驗，測定褪黑素和維生素B6含量，中間精密度結果如表6所示。由表6可知，該方法測定的褪黑素和維生素B6中間精密度符合方法驗證要求。

表6 中間精密度結果

2.2.6 耐用性結果

因此方法在2.1小節中已對前處理方法進行了考察，故此耐用性試驗僅針對儀器的色譜條件進行考察。取褪黑素片樣品，按1.3.3小節配制成供試品溶液，參考1.3.1小節的色譜條件，分別設置2，5和10 μL進樣量，設置25，30和35 ℃柱溫條件上機測定，考察此方法的儀器參數耐用性。檢測數據詳見表7。由表7可知，不同色譜條件下褪黑素和維生素B6測定結果SRSD均小于5%，故此方法具有較好的耐用性。

表7 不同進樣量和色譜條件下褪黑素和維生素B6測定結果

2.3 不確定度評定結果

由1.3.4小節不確定度評定數學模型可知，褪黑素和維生素B6的不確定度主要由標準物質、樣品前處理過程、重復測定、回收率及液相色譜儀引入。根據建立的模型，采用合成相對標準不確定度按式（2）計算。

式中：urel(x)為合成相對標準不確定度；ur(x1)為由標準物質引入的相對標準不確定度；ur(x2)為由樣品提取引入的相對標準不確定度；ur(x3)為由人員操作引入的相對標準不確定度；ur(x4)為由回收率引入的相對標準不確定度；ur(x5)為高效液相色譜儀引起的標準不確定度。

2.3.1 標準物質引入的標準不確定度

褪黑素和維生素B6標準物質的不確定度來源主要是標準溶液配制過程中使用的標準物質、容量瓶、吸量管、天平引入的不確定度。

褪黑素和維生素B6標準品純度分別為P(m)=99.6%和P(v)=100%，擴展不確定度均為2.0%，按矩形分布，褪黑素和維生素B6純度帶來的不確定度分量按式（3）和（4）計算。

所用天平為十萬分之一電子天平，稱取12.95 mg褪黑素，15.44 mg維生素B6，該天平經檢定合格，校準證書標明擴展不確定度為0.03 mg，k=2，稱量時需要去皮，則產生兩次稱量，其相對標準不確定度按式（5）和（6）計算。

標準溶液配制稀釋過程中由容量瓶引入的不確定度，使用50.00 mL和25.00 mL容量瓶各一次，10.00 mL容量瓶6次，根據計量證書所示，50.00，25.00和10.00 mL容量瓶的示值誤差不確定度U50=0.02 mL、k=2，U25=0.01 mL、k=2，U10=0.007 mL、k=2，則相對不確定度按式（7）計算。

標準溶液配制稀釋過程中使用吸量管1，5和10 mL，根據計量證書所示，1，5和10 mL吸量管的示值誤差不確定度分別為：Ux1=0.003 mL、k=2；Ux5=0.01 mL、k=2；Ux10=0.02 mL、k=2。標準母液使用10 mL吸量管2次，工作液有6個點，配制過程中1 mL吸量管使用了3次，吸取體積分別為0.25，0.5，1和5 mL的吸量管使用了3次，吸取體積分別為2，3.5和5 mL，則相對不確定度按式（8）計算。

溶液溫度與校準溫度不同產生的相對標準不確定度由于此實驗室溫度在（20±5）℃波動，液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故只考慮前者即可。所使用的容量瓶體積為50 mL，參考甲醇的體積膨脹系數為1.18×10-3℃，按矩形分布，則因溫度波動引入的液體體積的相對不確定度為按式（9）計算。

因實驗室溫度波動范圍一致，故后續對溫度引起體積變化的不確定將引用此處評估的相對不確定度。綜上，標準物質引入的相對標準不確定度按式（10）（11）計算。

2.3.2 樣品前處理過程引入的不確定度

試樣稱量過程使用的萬分天平，根據計量證書所示，天平的擴展不確定度U=0.000 5 g，k=2，稱量的平均質量為0.512 5 g，稱量時需要去皮，則產生兩次稱量，其引入的相對不確定度按式（12）計算。

試樣定容過程中使用100.00 mL和10.00 mL容量瓶，根據計量證書所示，容量瓶的擴展不確定度U100=0.03 mL、k=2，U10=0.007 mL、k=2，定容體積為100.00 mL；引用2.3.1小節溶液溫度與校準溫度不同產生的相對標準不確定度為0.35%，則樣品定容引入的相對不確定度按式（13）計算。

綜上，樣品前處理引入的相對標準不確定度按式（14）計算。

2.3.3 重復性引入的不確定度

重復測量10次，結果詳見2.2.4小節表4，實際檢測中測試結果為2次測量結果的平均值，引用表4中的相對標準偏差，則重復性引入的相對不確定度按式（15）和（16）計算。

2.3.4 回收率引入的相對標準不確定度

回收率測試7次，結果詳見2.2.5小節表5，褪黑素和維生素B6的平均回收率分別為97.2%和98.5%，則回收率引入的相對不確定度按式（17）和（18）計算。

2.3.5 高效液相色譜儀引入的相對標準不確定度

由高效液相色譜儀的說明書可知，該儀器檢測濃度的允許誤差為1%，按均勻分布處理。則按式（19）計算。

2.3.6 褪黑素和維生素B6合成總相對不確定度

褪黑素和維生素B6合成總相對不確定度為按式（20）和（21）計算。

2.3.7 褪黑素和維生素B6擴展不確定度

此次試驗取包含因子k=2，包含概率P=95%時，褪黑素和維生素B6的擴展不確定度分別為5.10%和4.68%，樣品中褪黑素的含量表示為5.21±0.27 mg/g，k=2，維生素B6的含量表示為5.43±0.25 mg/g，k=2。

3 結論

研究表明，褪黑素片中褪黑素和維生素B6可實現同步測定提升日常檢測效率。通過對此研究過程的試驗數據分析，此方法具有較好的準確度和精密度。此方法不確定度的主要來源為人員操作及回收率引入的隨機誤差，標準品、天平、移液管、容量瓶、液相色譜儀帶入的系統誤差。比較相對不確定度分量發現，隨機誤差對結果影響較大，故檢測過程中需要嚴格規范操作過程并遵守，系統誤差中標準物質對結果影響較大，需盡可能選擇不確定小的標準物質，同時使用偏差小的量器具和設備、控制實驗室溫度，提升檢測結果的穩定性和可靠性。