土壤大腸桿菌拮抗菌的分離鑒定

桑茜劉冰艷張雪嬌歐陽全喜諶馥佳陳建光

(1.安陽工學院，河南 安陽 455000；2.黃淮學院，河南 駐馬店 463000)

世界衛生組織(World Health Organization，WHO)監測報告顯示，由于缺乏科學引導，抗生素濫用導致的細菌耐藥性增加已成為全球日益嚴重的公共衛生問題[1，2]。大腸桿菌是一種分布廣泛的條件致病菌，極易產生耐藥性?？股鼗蚩咕幬锏拇罅渴褂么龠M了畜禽養殖業的發展，造成大腸桿菌耐藥菌株數量不斷增加、耐藥性不斷增強，加劇了大腸桿菌病的防治難度[3]。針對抗生素過度使用，通過益生菌調節腸道菌群的平衡已成為遏制大腸桿菌耐藥性增強的一項重要行動計劃。

常見的益生菌包括芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等。芽孢桿菌廣泛存在自然界中，宋兆齊等[4]通過菌株形態和生理生化的鑒定試驗，對整個河南省范圍內農田土壤環境中的芽孢桿菌多樣性進行了調查，調查結果從分子水平證明，河南省的芽孢桿菌資源非常豐富。芽孢桿菌是一類重要的微生態制劑和益生菌添加劑。田照輝等[5]從池塘邊發酵魚肉湯中分離出6株芽孢桿菌，對其產淀粉酶、產蛋白酶能力及生長情況進行研究，為篩選適合漁用微生態制劑的益生菌提供了新的思路。張同建[6]從健康的雞仔糞便種分離出9株芽孢桿菌，通過耐酸性試驗、耐膽汁試驗以及動物飼喂試驗，為研究芽孢桿菌菌株及開發成益生菌制劑提供一定的理論指導。張榮嶺[7]認為，芽孢桿菌具有拮抗病原菌、調節腸道菌群、提升機體免疫力、改善生產性能等作用。尹楊燕等[8]研究表明，枯草芽孢桿菌GX20200511-1對沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑菌效果，可以顯著降低共培養24h后的指示菌數量。崔亞微[9]研究證明，從土壤中分離鑒定的貝萊斯芽孢桿菌具有良好的耐酸、耐膽鹽及抗大腸桿菌作用，為其在動物養殖和飼料防霉中的應用提供堅實的理論依據。

目前國內外報道中，益生菌主要分離自動物腸道和非腸道(如植物和相關作物食品等)[10]，而分離自土壤中的芽孢桿菌則多應用于農業生物防治領域。崔曉等[11]報道利用芽孢桿菌開發的生防菌劑和生物制劑被廣泛應用。邱月[12]研究表明，枯草芽孢桿菌可以有效促進植物病蟲害的防治、促進植物營養吸收、提升作物產量品質和改良土壤品質。為了研究分離自土壤中的芽孢桿菌對大腸桿菌的抑制效果，本試驗從河南省駐馬店市試驗林中采用五點采樣法收集土壤樣品，通過菌株分離純化、大腸桿菌抑菌試驗、16S rDNA序列分析鑒定和系統發育樹構建獲得具有抑菌效果顯著的2株枯草芽孢桿菌FX5和FX6，為研究土壤芽孢桿菌作為益生菌防治大腸桿菌的潛質提供一定的理論依據。

1 材料

1.1 試驗材料

土壤樣品來源于河南省駐馬店市黃淮學院試驗林。大腸桿菌(Escherichia coli)由安陽工學院生物與食品工程學院生物技術實驗室提供。

1.2 主要儀器

高溫高壓蒸汽滅菌鍋(LDZLDZM-40KCKCS)，購于上海中安醫療器械廠；超凈工作臺(SW-CJ-2D型)，購于上海樹立儀器儀表有限公司；恒溫培養箱(SHP型)，購于北京中興偉業儀器有限公司；恒溫震蕩培養箱，購于江蘇科析儀器有限公司；離心機(Centrifuge 5230R)，購于德國艾本德公司。

2 方法

2.1 樣品的采集

采用五點取樣法從試驗林采集點采集5～10cm深的土壤。準備無菌紙袋，無菌紙袋中放入采集得到的土壤樣品，標記采集地點、時間、植被類型，將其放于陰涼通風處陰干，經研缽研碎備用。

2.2 菌株的分離和純化

采用李靜泉等[13]試驗方法，通過稀釋平板涂布法從土壤樣品中分離純化菌種。制備土壤懸浮液，向150mL無菌三角瓶中加入90mL滅菌生理鹽水，稱取10g土壤樣品加入三角瓶中，制成土壤懸浮液；制備濃度梯度懸浮液，用移液器吸取1mL土壤懸浮液于無菌試管中，加入9mL無菌水，混勻后從中吸取1mL加入第2個無菌試管中并加入9mL無菌水，以此類推制成10-3、10-4、10-53個濃度梯度的土壤菌懸浮液，每個濃度梯度重復3次；分離純化菌株，分別吸取不同稀釋度的土壤懸浮液200μL均勻涂布于LB(Luria-Bertani)培養基、高氏一號培養基上，重復3次，置于37℃恒溫培養箱中倒置培養24h，挑選菌落進行多次劃線純化得到純種菌株，將純種菌株轉入LB斜面培養基4℃保存。

2.3 牛津杯法抑制大腸桿菌試驗

挑取純化后的菌種，進行液體搖瓶培養，利用旋轉蒸發儀對菌液進行蒸餾，獲得純度較高的單菌落菌懸液。根據張同建[6]試驗方法將10mL大腸桿菌菌懸液與45℃的LB培養基在無菌培養皿中混勻；用滅菌后的打孔器在冷卻后的培養基上進行打孔(孔的直徑為0.6cm)；取100μL分離獲得的單菌落菌懸液置于每個孔中；將含有單菌落菌懸液的培養基放入恒溫培養箱中36.5℃恒溫培養12h，觀察記錄抑菌圈的大小。

2.4 16S rDNA序列分析鑒定

參考SK8255(細菌)Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)對大腸桿菌拮抗菌株進行細菌基因組DNA的提取。參考李肖鶴等[14]方法，利用細菌16S rDNA通用引物Primer A(5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和Primer B(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)為上下游引物對菌株的16 SrDNA進行基因擴增；PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，切膠回收，送至上海生工生物工程有限公司進行測序；獲得序列后上傳到GenBank中進行BLAST 序列分析比對；運用MEGA軟件構建系統發育樹[15]；參考菌株的菌落形態，綜合確定該菌株的親緣關系和種屬地位。

3 結果分析

3.1 菌株的分離和純化

經過初篩、復篩，在分離培養基上分離得到7株遺傳性狀穩定的土壤菌株，將其編號為FX1～7，各菌株的菌落形態特征見表1。

表1 菌落形態特征

3.2 牛津杯法抑制大腸桿菌試驗結果

參考張同建[6]方法對初步篩選得到的7株菌株進行大腸桿菌的抑菌性試驗，抑菌結果分析表明：依據抑菌圈直徑大小比照與分析，FX7菌株對大腸桿菌無抑制作用，另外6株目的菌株對大腸桿菌抑菌效果依次為FX5>FX6>FX3>FX2>FX1>FX4。FX1菌株和FX4菌株抑菌圈直徑分別為1.8mm和0.8mm，抑菌效果較弱；FX2菌株和FX3菌株抑菌圈直徑分別為10.2mm和11.6mm，抑菌效果一般；FX5菌株和FX6菌株抑菌圈直徑分別為20.9mm和18.1mm，菌株抑菌效果明顯，拮抗作用顯著。其中FX5菌株的抑菌圈直徑最大，抑菌能力最顯著，為后續挑選具有優良抑制大腸桿菌效果的微生物制劑提供一定的依據。

3.3 菌株的分子生物學鑒定結果

從圖1可以看出，菌株FX1～6提取的DNA堿基對在1200～2000bp。

圖1 FX1～6的DNA凝膠電泳分析

將對大腸桿菌具有拮抗效果的6株菌株的16S rDNA基因測序交由上海生工生物工程有限公司完成。測序結果與NBCI數據庫進行BLAST比對分析，并使用MEGA軟件繪制系統發育樹，見圖2，鑒定結果顯示FX1菌株與Amycolatopsis japonica strain MG 417-CF 17親緣性強，歸為擬無枝菌屬；FX3菌株與Streptomyces sp.strain 2H-HV12親緣性強，歸為鏈霉菌屬；FX4菌株與Bacillus paramycoides strain Mu3 AM親緣性強，歸為芽孢桿菌屬。FX2、FX5和FX6菌株與Bacillus sp.(in：Bacteria)strain親緣關系最近，結合其菌落培養特征初步確定菌株FX2、FX5和FX6歸為枯草芽孢桿菌，針對抑制大腸桿菌效果最優的拮抗菌株FX5和FX6后續應補充菌株的生理生化特性等試驗進行下一步研究。

圖2 FX1～6菌株的系統發育樹

4 討論與分析

芽孢桿菌數量龐大、種類繁多，廣泛應用于飼料加工、醫藥業、農業、工業等諸多行業，具有極強的適應能力、廣譜的生防潛力[16]和多方面的益生性能[17]。Bacon等[18]研究發現，玉米內生芽孢桿菌和玉米病原菌(串珠鐮孢菌)競爭玉米相同的生態位點可以降低病原菌的致病性。蔣廣志等[19]、趙榮等[20]等研究表明，在動物飼料中添加芽孢桿菌益生菌活菌制劑，使益生菌成為動物腸道內的優勢菌群，能夠有效控制和預防動物疾病。榮艷君等[21]等發現，解淀粉芽孢桿菌R3分泌的surfactin類抗菌脂肽通過改變細胞膜通透性能夠破壞細胞膜、裂解細胞，抑制產生多重耐藥性的大腸桿菌。本研究從自然土壤中篩選出6株大腸桿菌拮抗菌株，根據菌株生物學形態觀察與分子生物學鑒定分析，最終得到對大腸桿菌拮抗效果顯著的FX5和FX6菌株，與崔亞微[9]、楊熾光[16]研究結果一致，說明分離自自然土壤中的芽孢桿菌對大腸桿菌具有較好的抑制作用，為土壤益生菌的開發利用提供一些理論依據。

張榮嶺[7]報道枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是重要的工業菌株，也是飼料添加劑品種目錄中可直接飼喂動物的微生物添加劑菌種；目前以枯草芽孢桿菌及細菌素為主要成分的微生態制劑作為飼用抗生素替代品被廣泛使用。本試驗對大腸桿菌拮抗菌株進行BLAST比對分析和系統發育樹構建，結合其菌落培養特征，初步認為拮抗效果顯著的FX5和FX6菌株歸為枯草芽孢桿菌，后續應補充其生理生化特性的試驗和對其他有害細菌如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌拮抗效果的研究。本試驗為不斷豐富和開發利用具有優良大腸桿菌拮抗效果的土壤微生物資源提供了一定的理論依據和技術支持，可以考慮將FX5和FX6菌株嘗試運用于動物飼料添加劑中[22]，對其益生特性和益生作用機理做深入研究，為其合理應用提供理論依據。