水稻OsRLCK167 基因的組織表達模式和生物信息學分析

馬銀花，劉桃梅，萬天雪，肖新波，胡瓊，李萍芳，段仁燕，張斌，金晨鐘，杜波

(1. 湖南人文科技學院農業與生物技術學院，湖南婁底 417000；2. 武漢大學生命科學學院/雜交水稻國家重點實驗室，湖北武漢 430072)

類受體胞質激酶(receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs)是一類只含有胞內激酶結構域、無胞外信號肽結構域和跨膜結構域的特殊蛋白激酶家族，在植物的生長發育、病原菌防御、脅迫等過程中發揮著重要的生物學功能[1-4]。 研究表明這類蛋白在擬南芥中有200 個成員，水稻中有379 個成員，根據氨基酸序列的系統發育分支，RLCKs 在擬南芥中被分為13 個亞家族，在水稻中被劃分為17 個亞家族[3-6]，其在植物中通過磷酸化下游靶蛋白發揮功能，主要參與了植物的生長、信號轉導、非生物脅迫和生物脅迫應答等生理過程[7]。 其中研究最多的為RLCK Ⅶ亞家族在植物免疫中的作用，有關RLCK Ⅵ亞家族基因的研究很少。 對OsRLCK57、OsRLCK107、OsRLCK118和OsRLCK176功能特性進行的研究表明，其參與了XA21 介導的水稻先天免疫和BR 信號介導的水稻發育[8]；OsRLCK102是RLCK Ⅶ亞族蛋白基因，同時受生物與非生物脅迫的誘導表達，參與了水稻的生長發育與免疫反應的調控[9，10]。

近些年，擬南芥中RLCK Ⅵ亞家族蛋白參與植物生長與病原體防御相繼被報道，如Rop 結合蛋白激酶1 和2(RBK1 和2)直接結合AtRop4 GTPase，是植物生長和病原體防御中多種信號傳導途徑的重要調節子[11]；Rop 相互作用類受體激酶1 和2(AtRRK1 和2)可以在體外被GTP 結合的Rop GTP 酶特異性激活[12]；屬于RLCK Ⅶ亞家族的BIK1 和PBL1 與細胞膜上的受體激酶FLS2和BAK1 相互作用，并且BIK1 和PBL1 在FLS2被其配體flg22 激活時迅速磷酸化，bik1和pbl1突變體在其FLS2 介導的免疫應答中表現出表型缺陷，表明BIK1 和PBL1 在FLS2 和BAK1 的相互作用介導的PTI 信號傳導過程中具有重要作用[13，14]。

與擬南芥RLCK Ⅵ亞家族相比，對于水稻中RLCK Ⅵ亞家族基因的研究報道更為稀少。 Os-RRK1(對應編號為OsRLCK216)是一個與OsLec-RK 相互作用的蛋白，也是少有被報道過的水稻RLCK Ⅵ亞家族成員，研究發現OsRRK1 在葉片發育與稻飛虱抗性等方面發揮著重要作用；Os-RRK1基因的過表達能使得水稻葉片卷曲，表明RLCK Ⅵ亞家族可能在水稻發育和免疫方面發揮作用[4，15-17]。 前期課題組在對OsRRK1基因與其他RLCK Ⅵ亞家族成員同源蛋白的系統發育分析研究中發現OsRLCK167與其同源性很高，同屬于RLCK Ⅵ家族成員。 利用生物信息學分析可以研究蛋白質序列、結構以及功能，并對蛋白質進行同源分析，研究蛋白質之間的進化關系，揭示蛋白質家族間的關系[18-20]。 因此對OsRLCK167 蛋白的理化性質、蛋白結構等方面進行生物學信息學分析，可為深入研究其生物學特征提供一定理論基礎；通過熒光定量PCR 對OsRLCK167進行組織表達模式分析，推測其在水稻葉片生長發育過程中可能發揮的作用能進一步豐富對水稻RLCK Ⅵ亞家族基因功能的研究，深化對該家族基因的認識，以期為深入探究水稻RLCK Ⅵ亞家族蛋白在水稻中的生物學功能和挖掘水稻抗性新基因提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

粳稻品種Hejiang 19(H1493)購自國家種質資源庫，用于提取水稻RNA；OsRRK1和OsRLCK167的ORF 序列；Escherichia coli菌株TOP10為武漢大學雜交水稻國家重點實驗室何光存教授課題組提供。

1.2 生物學信息分析

運用ExPASy-Protparam、Protscale、NCBI 網站的CD-search、SOPMA、Phyre 和Psort 等在線工具對OsRLCK167 蛋白的理化性質、二級結構、三級結構和亞細胞定位進行生物信息學預測與分析。

1.3 同源基因序列比對與進化樹分析

通過DNAMAN 軟件將OsRLCK167基因與OsRRK1基因進行序列比對，再用MEGA 5.10 對OsRLCK167 蛋白、水稻中與OsRLCK167 相似性較高的5 個RLCK 和擬南芥RLCK ⅥA 家族的7個成員構建系統發育進化樹。

1.4 組織表達模式分析

采用TRIzol 試劑(Invitrogen， USA)提取粳稻品種Hejiang 19(H1493)的幼芽、幼根、二分蘗期的根、二分蘗期的葉、成熟期的劍葉、倒二葉、莖、葉鞘、幼穗等組織mRNA；RNA 的反轉錄按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)

的操作步驟進行；用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物qRT-OsRLCK167f:5＇-CCTCGTCCTTCCCTCTCGTG-3＇和qRT-OsRLCK167r:5＇-CTGCTGCTGCTGTCTGTCTC-3＇；以反轉錄產物為模板，以水稻Actin基因為內參，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析OsRLCK167在不同組織中的表達模式，每個樣品3 次重復。 PCR 反應體系:DNase/RNase-Free ddH2O(TIANGEN) 2.9 μL，2×Super mix 4 μL，上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL，cDNA 模板0.5 μL。 反應程序:95℃變性2 min；95℃變性5 s；60℃退火20 s，共40 個循環。

2 結果與分析

2.1 OsRLCK167 蛋白的生物信息學分析

2.1.1 OsRLCK167 蛋白的理化性質分析OsRLCK167基因編碼含有391 個氨基酸的蛋白質，通過ExPASy-Protparam 在線工具對OsRLCK167 蛋白的理化性質進行分析，結果顯示該蛋白分子式為C1920H2951N547O600S15；相對分子量為43.77776 kD；理論等電點為4.87；富含強堿性氨基酸(Arg、Lys 共42 個)和強酸性氨基酸(Asp、Glu 共67個)，蛋白質不穩定指數為47.35，為不穩定蛋白，脂肪系數為77.83。 氨基酸組成分析結果表明，天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)所占比例較高，分別為10.0%、9.7%、7.7%、7.7%、7.4%、7.4%、7.2%，甲硫氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)占比較低，分別為1.5%和1.8%(表1)。 OsRLCK167 蛋白的親水性預測表明，OsRLCK167 蛋白的氨基酸組成中大多為疏水性氨基酸，因此該蛋白為疏水性蛋白(圖1)。 綜上，OsRLCK167 蛋白是一個疏水性的、不穩定的酸性蛋白。

圖1 OsRLCK167 蛋白的疏水性/親水性預測分析

表1 OsRLCK167 蛋白的氨基酸含量

2.1.2 OsRLCK167 蛋白保守功能域的預測 通過NCBI 網站的CD-search 工具對OsRLCK167 蛋白的保守功能域進行預測，OsRLCK167 蛋白特定匹配(specific hits)在SPS1，非特定匹配(non-specific)在STKc_IRAK(圖2)，因此，OsRLCK167 蛋白屬于PKc_like superfamily(RKc_like 超級家族)。

圖2 OsRLCK167 蛋白的保守功能域

2.1.3 OsRLCK167 蛋白的二級結構預測 通過在線網站SOPMA 預測OsRLCK167 蛋白的二級結構，結果表明，OsRLCK167 蛋白的二級結構主要由無規則卷曲(random coil 41.94%)、α-螺旋(alpha helix 35.29%)、延伸鏈(extended strand 15.35%)和β-轉角(beta turn 7.42%)組成(圖3)。 因此，該蛋白晶體的空間構象可能以無規則卷曲結構為基礎所構成的。

圖3 OsRLCK167 蛋白的二級結構預測

2.1.4 OsRLCK167 蛋白的三級結構預測 通過在線軟件Phyre 對OsRLCK167 蛋白三級結構模型進行預測分析表明，該蛋白由α-螺旋(alpha helix)、β-轉角(beta turn)和無規則卷曲(random coil)連接而成(圖4)。

圖4 OsRLCK167 蛋白的三級結構預測

2.1.5 OsRLCK167 蛋白的亞細胞定位 通過在線網站Psort 進行預測分析表明，該蛋白最可能定位于細胞質，這與OsRRK1 蛋白的亞細胞定位在細胞質的結果一致[16]，其次可能定位于線粒體、細胞核和內質網，定位于分泌系統囊泡和液泡的可能性較低(表2)。

表2 OsRLCK167 蛋白的亞細胞定位

2.2 OsRLCK167 同源基因序列比對與進化分析

對OsRRK1及同源基因OsRLCK167序列進行比對分析發現，OsRRK1的ORF 序列為1179 bp，OsRLCK167的ORF 序列是1176 bp，兩者長度接近。OsRLCK167含有6 個外顯子、5 個內含子。用DNAMAN 軟件將兩者的ORF 序列進行比對，兩者的一致性達70.06%(圖5)。

圖5 水稻OsRRK1 與OsRLCK167 的序列比對

將OsRLCK167 蛋白、水稻中與OsRLCK167相似性較高的5 個RLCK 和擬南芥RLCK ⅥA 家族的7 個成員做親緣關系分析發現，OsRRK1 與RLCK ⅥA 亞家族親緣關系最近；進化樹分析結果表明，OsRLCK167 屬于RLCK ⅥA 亞家族成員，并且與水稻中的OsRRK1 同源性最高(圖6)。

圖6 OsRRK1 與擬南芥和水稻中其他RLCK 家族的進化分析

2.3 OsRLCK167 基因的組織表達模式分析

由圖7 可知，OsRLCK167基因在葉鞘中的表達量最高，其次是在劍葉和倒二葉中；在幼芽、幼根、二分蘗期的根中表達量很低；二分蘗期的葉、莖和幼穗中表達量較低。OsRRK1基因在所檢測的組織中都有表達，是一個組成性表達基因；Os-RRK1基因在水稻生長發育的各個時期都有表達，在葉片中的表達量較高，在抽穗期的劍葉中表達量最高[17]。 通過對比分析表明，OsRRK1和Os-RLCK167并非同一基因，在不同組織中表達量存在一定差異；另一方面，OsRRK1和OsRLCK167是同源基因，且在水稻生長發育的各個時期都有表達，但組織表達模式完全不同，這暗示兩個基因雖然結構上相似，但基因功能可能不同。

圖7 OsRLCK167 基因在水稻不同組織中的表達量

3 討論與結論

RLCK 家族基因存在多種植物中，并在植物生長、發育、防御等方面起著重要作用。 采用生物信息學方法進行分析，約60%的水稻RLCK基因序列中含有至少5 個內含子，379 個水稻RLCK基因的內含子數目從0 到26 個不等，約70%左右的RLCK 蛋白序列中只含有1 個蛋白激酶結構域，且參與許多重要的生理過程[3，7，11，21，22]。 而OsRLCK167 蛋白屬于RLCK ⅥA 亞家族成員，并且與水稻中的OsRRK1 同源性最高，從基因序列對比來看，OsRLCK167與OsRRK1序列長度十分接近，一致性達到70.06%，且OsRLCK167基因在根、莖、葉、葉鞘等均有表達，說明OsRLCK167基因可能與OsRRK1基因一樣參與多個組織器官的發育過程。 前期研究已發現OsRRK1 與水稻植株葉片直立有關，OsRLCK167 也與水稻葉片生長發育相關，其在水稻生長發育中的功能可能與OsRRK1相似，但基因功能可能不同；將OsRRK1抑制表達的轉基因植株與野生植株對比，沒有產生顯著的表型差異，且發現其同源基因OsRLCK167在Os-RRK1抑制表達轉基因植物中的表達量與野生型相比并無差異。 據此我們推測，抑制OsRRK1基因的表達并不影響水稻葉發育表型的原因可能是OsRRK1基因與同源基因OsRLCK167存在功能冗余關系。

本研究表明，OsRLCK167 是一個具有疏水性、保守的、酸性、不穩定蛋白，以高水平、保守方式調控水稻多個生物學過程，且與同源基因Os-RRK1在組織表達模式上相似。 本研究進一步豐富了對RLCK Ⅵ亞家族基因的研究，為后續深入研究OsRLCK167 蛋白的不同生理功能提供了理論基礎。