希爾斯山羊草1Ss S 和3Ss S 染色體特異dCAPS 標記的建立

倪佳俊，韓冉，徐文競，王開，祁廣，曾小雪，訾妍，李豪圣，劉建軍，汪曉璐，劉成

(1. 魯東大學農學院，山東煙臺 264025；2. 山東省農業科學院作物研究所/小麥玉米國家工程研究中心/農業農村部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術創新中心，山東濟南 250100)

小麥(Triticum aestivum， 2n ＝6x ＝42，AABBDD)是世界上最重要的糧食作物之一[1]。近年來，中國小麥種植面積穩定在2400 萬公頃左右，占全球小麥種植面積的10.9%[2]。 然而，由于近幾十年來少數優異親本的廣泛使用以及新病原菌的變異，導致我國小麥生產面臨著遺傳基礎狹窄及抗病性喪失的雙重問題[3]。 小麥近緣種屬中蘊藏著豐富的優異性狀，如抗病、抗逆和抗蟲等特性，為小麥的遺傳改良提供了珍貴的基因資源[4，5]。 山羊草屬(Aegilops)包含20 多個物種，廣泛分布于世界各地，是小麥抗病基因的重要來源[1]。 希爾斯山羊草(Ae.searsiiFeldman ＆Kislevex Hammer，2n ＝2x ＝14，SsSs)主要分布于以色列、約旦、敘利亞西南部和黎巴嫩東南部的亞地中海地區[6]，高抗小麥葉銹病和白粉病[7]、稈銹病[6]以及禾谷類二叉蚜蟲[8]，對干旱和鹽脅迫也有較好的抗性[9]。

分子標記可以用于鑒定和追蹤小麥背景中近緣物種染色體。 目前，應用最為普遍的基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的分子標記主要有簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)標記、競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)和限制性內切酶多態性(cleavable amplified polymorphic sequences，CAPS)標記等。 CAPS 標記是在序列信息及單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點已知的條件下，用限制性內切酶對PCR 產物進行酶切而產生長度多態性的目標片段。 由于多數SNP 不在限制性內切酶位點上，不能直接轉化為CAPS 標記，人們常通過PCR 在SNP 位點的側翼引入突變堿基，將其改造為限制性內切酶位點，進而產生長度多態性的目標片段，該技術被稱為衍生限制性內切酶多態性標記(dCAPS)[10]，具有共顯性、位點特異性、操作簡單、成本低等特點，目前已成功用于作物分類和輔助育種等研究[11-13]。

為了獲得更多的小麥-希爾斯山羊草染色體易位系用于定位希爾斯山羊草優異性狀并將其用于小麥遺傳育種，本試驗室從美國引進了中國春-希爾斯山羊草1Ss～7Ss附加系，并將這套附加系分別與小麥進行雜交，獲得了一大批雜交后代材料。 然而，分子標記的缺乏極大地限制了這批雜交后代材料的有效篩選與鑒定。 因此，本研究基于希爾斯山羊草重測序的SNP 分析，開發了希爾斯山羊草新的dCAPS 分子標記，為小麥背景中希爾斯山羊草染色質的檢測提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料如表1 所示。 中國春(Chinese Spring，CS)由電子科技大學楊足君教授提供。 序號2～23 的材料由美國堪薩斯州立大學的小麥遺傳和基因組資源中心的John Raupp 先生提供。序號24 ～31 的材料是山東省農業科學院作物研究所小麥遺傳育種研究團隊自育品種(系)。

表1 試驗材料

1.2 樣品檢測及文庫構建

(1)利用DNA 提取試劑盒(QIAGEN，德國)提取希爾斯山羊草葉片的基因組DNA；(2)瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 降解程度以及是否有RNA污染；(3)紫外分光光度計檢測DNA 的純度(OD260/OD280比值)；(4)Qubit 對DNA 濃度進行精確定量。 選取OD 值在1.8 ～2.0 之間、含量在1.5 μg 以上的DNA 樣品用于建庫。

檢驗合格的DNA 樣品用Covaris 破碎機隨機打斷成長度為350 bp 的片段，采用TruSeq 文庫構建試劑盒，經末端修復、加ployA 尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫構建。 構建好的文庫通過Illumina HiSeq 進行測序。

1.3 數據分析

對測序得到的原始數據進行質控得到過濾后數據:(1)去除帶接頭的雙端讀數；(2)當單端測序讀數中含有的N 含量超過該條讀數長度比例的10%時，去除此對雙端讀數；(3)當單端測序讀數中含有的低質量(Q≤5)堿基數超過該條讀數長度比例的50%時，去除此對雙端讀數。 有效測序數據通過BWA 軟件[14](參數為mem-t4-k32-M)比對到小麥參考基因組(ftp:/ /ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release - 46/fasta/triticum_aestivum/dna/Triticum_ aestivum. IWGSC. dna. toplevel.fa.gz)，比對結果經軟件SAMTOOLS[15]去除重復(參數為rmdup)。

1.4 SNP 檢測及注釋

利用軟件SAMTOOLS[15](參數為mpileupm2-F0.002-d1000)進行個體SNP 檢測。 為了降低SNP 檢測的錯誤率，選用如下標準進行過濾:(1)SNP 的讀數支持數不低于4；(2)SNP 的質量值(MQ)不低于20。 利用軟件ANNOVAR 對SNP檢測結果進行注釋。

1.5 dCAPS 標記開發

利用dCAPS Finder 2.0(http:/ /helix.wustl.edu/dcaps/)軟件設計差異堿基序列的酶切位點及上游或下游引物，再利用Primer Premier 5.0 設計序列另一端的下游或上游引物。

1.6 DNA 提取

供試材料基因組總DNA 用快捷型植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取。 取約100 mg 葉片放入2 mL 離心管(提前加入直徑2 mm 的鋼珠)中，液氮中速凍，然后用SCIENTZ-192 組織研磨機在30 Hz 頻率下將葉片打碎至粉末，加入400 μL 緩沖液FP1 和6 μL TNase，渦漩振蕩1 min，室溫放置10 min。 然后加入130 μL 緩沖液FP2，輕輕混勻，渦旋振蕩1 min。 12000 r/min 離心5 min，將上清轉移至新的離心管中。 向上清液中加入70%體積的異丙醇，充分混勻，12000 r/min 離心2 min，棄上清，保留沉淀。 加入500 μL 70%乙醇洗滌DNA，12000 r/min 離心2 min，棄上清，再次用500 μL 70%乙醇洗滌一次，步驟與第一次相同。 晾干后加入TE 溶解DNA 備用。

1.7 PCR 擴增及酶切

根據引物合成推薦的退火溫度進行PCR 擴增。 PCR 反應體系(15 μL):DNA(25 ng/μL)1.0 μL，2×PCR mix 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，用無菌雙蒸餾水補充反應體系至15 μL。PCR 反應擴增程序為:94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環；最后72℃延伸10 min。

PCR 擴增結束后，采用相應的內切酶(Thermo Scientific 公司提供)進行酶切。 酶切反應體系(5 μL):內切酶0.2 μL，快速酶切緩沖液1 μL，無菌雙蒸餾水補充反應體系至5 μL。 37℃酶切15 min。 酶切產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后凝膠在紫外凝膠成像儀GDS-Gel Dol 2000下掃描照相。

2 結果與分析

2.1 基因組重測序數據質量評估及基因組比對情況

本次測序共產生原始數據149.713 G，過濾后的數據149.389 G，各樣本的原始數據為149713.013 M，測序質量高(Q20≥96.38%、Q30≥91.08%)，GC 含量47.27%。 綜上，所有樣本的數據量足夠，測序質量合格，GC 分布正常，建庫測序成功。

參考基因組大小為14547 261565 bp，所有樣本的比對率為97.26%，對參考基因組(排除N區)的平均覆蓋深度為29.82×，1×覆蓋度(至少有一個堿基的覆蓋)在43.43%以上。 比對結果正常，可用于后續的變異檢測及相關分析。

2.2 SNP 位點檢測及注釋

檢測到的SNP 位點總數為8390 257。 基因上游1 kb 區變異位點數量為148038，基因下游1 kb 區位點數量為145070，同屬兩個基因上下游1 kb 區位點數量為6558，基因間區位點數量為7075 127，獲得終止密碼子位點數量為1190，喪失終止密碼子位點數量為335，外顯子區同義變異位點數量為237253，非同義變異位點數量為161321，內含子區位點數量為513874，剪接位點數量為653，轉換位點數量為5346 489，顛換位點數量為3043 768，全基因組雜合率(雜合SNP 個數)為0.131。

2.3 dCAPS 標記開發及鑒定

依據整理的SNP 序列信息，結合dCAPS 軟件，設計了150 對dCAPS 標記引物，最終篩選出2個dCAPS 標記用于檢測中國春-希爾斯山羊草附加系。 標記信息如表2 所示。

表2 dCAPS 標記信息

PCR 擴增及電泳檢測結果發現，這2 對引物能在中國春-希爾斯山羊草附加系中擴增出不同的多態性條帶。 AESD23 在中國春-希爾斯山羊草1Ss附加系中擴增出1800 bp 左右的多態性條帶；AESD105 在中國春-希爾斯山羊草3Ss附加系中擴增出200 bp 和300 bp 左右的多態性條帶(圖1)。

圖1 2 對dCAPS 引物在中國春-希爾斯山羊草附加系中擴增產物的電泳檢測圖譜

為了驗證這2 對引物可以用于檢測希爾斯山羊草雜交后代，我們又以濟南17、濟麥20、濟麥22、濟麥23、濟麥4075 和濟麥6206 為材料進行PCR 擴增。 結果發現，這2 對引物可以在含有希爾斯山羊草染色體的附加系中擴增出多態性條帶，而在中國春等六倍體普通小麥中沒有擴增出多態性條帶(圖2)。

圖2 2 對dCAPS 引物在中國春等普通小麥中擴增產物的電泳檢測圖譜

對這兩個引物分別在中國春與中國春-希爾斯山羊草1Ss附加系雜交F2后代和3Ss附加系雜交F2后代上隨機點樣，發現AESD23 只在中國春-希爾斯山羊草1Ss附加系上擴增出多態性條帶，而AESD105 只在中國春-希爾斯山羊草3Ss附加系上擴增出多態性條帶(圖3)。

圖3 2 對dCAPS 引物在附加系雜交后代中的擴增電泳檢測圖譜

另外我們分別用AESD23 和AESD105 在中國春-希爾斯山羊草的1SsS 和1SsL 端體附加系、3SsS 和3SsL 端體附加系中擴增，發現這兩對引物分別在中國春-希爾斯山羊草1SsS 端體附加系和3SsS 端體附加系中擴增出多態性條帶(圖4)，說明這兩對引物分別定位在1SsS 染色體和3SsS 染色體上。

圖4 2 對dCAPS 引物在端體附加系中的擴增電泳檢測圖譜

3 討論與結論

3.1 希爾斯山羊草基因組重測序結果的重要性

目前，許多研究報道了在小麥近緣物種中利用基因組測序開發分子標記，能夠更精確地鑒定抗病基因，從而為將小麥近緣物種的優異基因導入小麥提供有利保障。 Xu 等[16]利用粗山羊草基因組測序信息，比較了SNP 標記和SSR 標記對繪制QTL 圖譜的差異，分析了小麥染色體3A、3B 和3D 上21 個鐮刀菌抗性QTLs。 Bansal 等[17]通過基因組測序將小傘山羊草漸滲系抗葉銹病和條銹病基因定位在5DS 末端染色體。 Liu 等[18]利用RNA 測序技術開發高大山羊草4S 特異分子標記，通過誘導同源重組從4S 染色體上轉移Bgt抗病基因。 Li 等[19]通過對5 種山羊草(二角山羊草、高大山羊草、希爾斯山羊草、沙融山羊草和擬斯卑爾脫山羊草)染色體水平的基因組序列進行組裝，分析了小麥B 基因組的進化關系，為分析小麥-山羊草進化和遺傳研究提供了新思路。 希爾斯山羊草作為小麥近緣種屬，具有抗病、抗蟲和抗逆等優異性狀[6-9]，但關于其基因組重測序的研究甚少。 本研究對希爾斯山羊草基因組進行重測序，結果顯示測序質量好，數據可靠，后續可用于開發標記和用于比較基因組分析。

3.2 開發的標記可用于檢測雜交后代

Sun 等[20]通過對希爾斯山羊草高分子量谷蛋白的分析，開發了可以檢測小麥背景中1Ss染色體的生化標記。 Garg 等[21]對中國春-希爾斯山羊草1Ss～7Ss附加系進行分析，發現希爾斯山羊草1Ss染色體上含有新型高分子量谷蛋白亞基，對希爾斯山羊草1Ss染色體上的高分子量谷蛋白亞基基因進行了克隆并建立了分子標記。Liu 等[6]以中國春、希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草3Ss附加系及端體系為材料，篩選小麥EST-STS 引物，獲得了希爾斯山羊草3Ss染色體特異標記，用這批標記鑒定了希爾斯山羊草3Ss染色體的整臂易位系，結合抗病性鑒定將抗稈銹病基因定位在3SsS 染色體上。 Gong 等[22]以中國春、綿陽11、綿陽15、希爾斯山羊草、小麥-希爾斯山羊草1Ss～7Ss附加系、小麥-希爾斯山羊草染色體端體系為材料，篩選EST-STS、EST-SSR、COS、PLUG 和SSR 引物，建立了希爾斯山羊草1SsS、1SsL、2SsS 和2SsL 染色體臂特異標記，并對相應雜交后代群體材料進行了擴增驗證，為小麥背景中希爾斯山羊草染色體的檢測提供了方法。 Liu等[23]以中國春、希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2Ss附加系及端體系為材料，篩選小麥ESTSTS 引物，獲得了希爾斯山羊草2Ss染色體特異標記，用這些標記鑒定了涉及希爾斯山羊草2Ss染色體小片段易位系，結合抗病性鑒定將抗白粉病基因Pm57 定位在2SsL 染色體上。 但是目前對希爾斯山羊草dCAPS 標記的研究缺乏。

本研究通過對希爾斯山羊草基因組重測序SNP 的分析，開發了2 個dCAPS 標記，分別位于希爾斯山羊草1Ss和3Ss染色體上，并且都位于短臂上。 Garg[21]和Wang[4]等將顯著提高小麥品質及籽粒鐵和鋅元素含量的基因都定位在希爾斯山羊草1Ss染色體上，Liu 等[6]將抗小麥稈銹病基因Sr51定位在希爾斯山羊草3Ss染色體上，因此希爾斯山羊草1Ss和3Ss上可能攜帶豐富的與小麥品質和抗病相關的基因。 我們開發的新的dCAPS 標記可作為其特異標記檢測希爾斯山羊草的雜交后代，為小麥近緣物種標記開發提供新的研究思路，也為挖掘小麥抗病和優質基因提供有利保障。

3.3 開發標記的效率

Liu 等[6]分別從170 個小麥SSR 引物和144個STS-PCR 引物中篩選到2 個和18 個希爾斯山羊草3Ss染色體特異標記，開發標記效率為1.17%和12.50%。 Liu 等[23]又分別從96 個STS-PCR和95 個全長cDNA(FlcDNA)引物中篩選到希爾斯山羊草2Ss染色體特異標記1 個和3 個(長臂和短臂各2 個)，開發標記效率為1.04%和3.16%。Gong 等[22]從476 個EST 或SSR 引物中共篩選到17 個希爾斯山羊草1Ss或2Ss染色體標記，開發標記的效率為3.57%。 可見，上述研究報道的希爾斯山羊草標記開發效率在1.04%～12.50%之間。本研究從150 對dCAPS 引物中篩選出2 個希爾斯山羊草特異標記，開發標記的效率為1.33%。開發標記的效率不是特別高的原因可能是基因組重測序中存在大量的重復序列，產生許多錯誤的重疊，造成拼接產生的序列過短，因此獲得的SNP位點相對減少。 但我們開發的標記仍可以作為篩選希爾斯山羊草染色體的特異標記，用于鑒定小麥-希爾斯山羊草后代材料。