不同成熟度雪茄煙葉的抗氧化特性及其品質(zhì)分析

管慶林，康家豪，睢雅琳，陶玉嬌，秦艷青，雷云康，王俊，趙銘欽

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/國家煙草栽培生理生化研究基地，河南鄭州 450002；2. 中國煙草總公司四川省公司，四川成都 610041；3. 四川省煙草公司德陽市公司，四川德陽 618400)

成熟度是影響煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，雪茄煙由于其晾制周期較長，成熟度對(duì)煙葉品質(zhì)的影響更為突出[1，2]。 煙葉成熟過程中，植株體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，如過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及還原型谷胱甘肽(GSH)、木質(zhì)素等抗氧化物質(zhì)含量降低，膜脂發(fā)生過氧化，細(xì)胞膜受到損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3，4]。 種子中活性氧(ROS)清除體系主要包括酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)。 酶促抗氧化系統(tǒng)主要由過氧化氫酶、過氧化物酶及丙二醛組成，非酶促抗氧化系統(tǒng)主要由苯丙氨酸解氨酶、還原型谷胱甘肽及木質(zhì)素組成[5]。 當(dāng)植物體內(nèi)活性氧水平上升時(shí)，過氧化物酶及過氧化氫酶活性隨之升高，植物對(duì)活性氧的清除能力增強(qiáng)，進(jìn)而提升植物品質(zhì)[6]。 車燕萍[7]研究認(rèn)為，外施GSH 和OTC(L-2-噻唑林二酮-4-甲酸，GSH 合成促進(jìn)劑)，導(dǎo)致TMV 誘導(dǎo)的ROS 積累減少，丙二醛(MDA)含量降低。 酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量與其過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性及非酶促抗氧化能力密切相關(guān)[8]。 盧紹浩等[9]研究認(rèn)為，雪茄煙葉晾制期間合理調(diào)控溫度，煙葉PAL 活性較高，有利于提高煙葉的抗氧化能力。 宋瑞芳等[10]研究認(rèn)為，植物受到病原體感染后PAL 活性升高，且PAL 活性的升高與木質(zhì)素的產(chǎn)生和積累呈正相關(guān)。

目前，有關(guān)不同成熟度條件下烤煙葉片膜脂過氧化特性研究已有許多[11-13]。 而成熟度對(duì)雪茄煙葉抗氧化特性與品質(zhì)效應(yīng)影響的研究尚未見到報(bào)道。 本試驗(yàn)以雪茄煙品種德雪3 號(hào)、德雪5號(hào)為材料設(shè)置不同成熟度處理，并以四川德陽當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)采收成熟度為對(duì)照，研究各成熟度處理對(duì)雪茄煙葉抗氧化特性及其品質(zhì)的影響，旨在為四川優(yōu)質(zhì)雪茄煙原料生產(chǎn)中最適成熟度選取提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020 年在四川省什邡市洛陽村進(jìn)行。供試雪茄煙品種為德雪3 號(hào)、德雪5 號(hào)。 試驗(yàn)田土壤為水稻土，有機(jī)質(zhì)含量為3.0 g/kg、堿解氮120 mg/kg、速效磷38.1 mg/kg、速效鉀89 mg/kg，pH 值為6.3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與田間管理

采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)處理(M1、M3 和M4)和對(duì)照(M2，當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)采收成熟標(biāo)準(zhǔn))，重復(fù)3 次。 參考趙松超等[14]制定的成熟度標(biāo)準(zhǔn)(表1)實(shí)施處理。 選取中部葉(自下而上第10～12 葉位)取樣并液氮冷凍保存，用于抗氧化特性指標(biāo)測定。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣葉外觀特征描述

4 月30 日移栽，行距120 cm，株距40 cm。煙田施氮(N)180 kg/hm2(煙草專用復(fù)合肥)，N ∶P2O5∶K2O＝1∶0.5∶3，分別于起壟整地時(shí)條施和移栽后30 d 追施，肥料基追比為7∶3。 其它田間農(nóng)事操作與管理均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一進(jìn)行。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 抗氧化特性相關(guān)指標(biāo)測定 采用愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性[15]，分光光度計(jì)法測定CAT活性[16]和PAL 活性[17]，雙組分分光光度計(jì)法測定MDA 含量[15]， 酶循環(huán)法測定GSH 含量[18]，采用NaOH/尿素低溫溶解法[19]測定木質(zhì)素含量。

1.3.2 干物質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測定 每處理選取3 株長勢均勻一致植株的中部葉做好記錄。 葉片采收后于105℃下殺青15 min，再65℃烘干至恒重稱干重，重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3 常規(guī)化學(xué)成分測定 取各處理晾制后煙葉，烘干磨碎過60 目篩。 準(zhǔn)確稱取0.25 g 煙樣于50 mL 小白瓶中，瓶內(nèi)加5%醋酸溶液25 mL，振蕩30 min 后過濾，之后采用流動(dòng)分析法測其常規(guī)化學(xué)成分含量[20]。

1.3.4 感官質(zhì)量評(píng)價(jià) 堆垛發(fā)酵后煙葉，經(jīng)回潮、卷制和煙支養(yǎng)護(hù)等工序后制成雪茄煙待評(píng)吸標(biāo)準(zhǔn)樣品，由國家煙草栽培生理生化研究基地與四川省煙草公司德陽市公司共同邀請四川、湖北、安徽、山東、浙江、河南等省工業(yè)公司以及上煙集團(tuán)有關(guān)專家組成煙葉質(zhì)量評(píng)吸委員會(huì)對(duì)其進(jìn)行評(píng)析評(píng)價(jià)。 評(píng)價(jià)指標(biāo)包括屬性特征、香韻、勁頭、濃度、香氣質(zhì)、香氣量、余味、雜氣、刺激性、甜度、灰色共11 項(xiàng)指標(biāo)，各指標(biāo)均取算術(shù)平均值，即為各樣品各指標(biāo)的得分。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖，運(yùn)用DPS 7.05 軟件進(jìn)行顯著性分析(P＜0.05)及抗氧化特性指標(biāo)與干物質(zhì)含量的簡單相關(guān)分析，采用Duncan’s 法進(jìn)行處理間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉酶促抗氧化特性的影響

由圖1A 可知，2 個(gè)雪茄品種煙葉CAT 活性隨成熟度增加均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，均在M3 時(shí)最高，之后下降，至M4 階段降幅分別達(dá)39.3%和31.0%。 2 個(gè)品種葉片成熟度在M1到M3 之間保持較高的CAT 活性，之后德雪3 號(hào)急速下降，德雪5 號(hào)下降略緩。 不同成熟度條件下品種間的CAT 活性差異較大，M1、M2 時(shí)德雪5號(hào)高于德雪3 號(hào)，M3、M4 時(shí)德雪3 號(hào)高于德雪5號(hào)。

圖1 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉CAT、POD 活性及MDA 含量的影響

從圖1B 看出，2 個(gè)品種煙葉POD 活性隨成熟度增加均呈先緩慢升高后快速降低的趨勢，即在M3 達(dá)到峰值后開始下降，至M4 時(shí)分別降低39.33%和44.92%。 煙葉成熟衰老過程中，德雪5號(hào)煙葉POD 活性總體上均高于德雪3 號(hào)，二者間差異在M2 時(shí)達(dá)到最大。

丙二醛含量可以表征煙葉細(xì)胞膜脂過氧化水平[21]。 由圖1C 可知，隨著煙葉成熟進(jìn)程的延伸，煙葉MDA 含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，峰值出現(xiàn)在M2。 不同成熟度之間比較，2 個(gè)品種煙葉MDA 含量均表現(xiàn)為M2＞M1＞M3＞M4。

2.2 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉非酶促抗氧化特性的影響

由圖2A 可以看出，隨著雪茄煙葉成熟進(jìn)程延伸，煙葉GSH 含量呈先降低后上升即“V”形變化趨勢，其低谷值出現(xiàn)在尚熟(M2)即生理成熟階段。 2 個(gè)品種雖然GSH 含量在不同成熟條件下存在一定差異，但總的變化趨勢一致，說明當(dāng)煙葉處在尚熟階段時(shí)，GSH 正與相關(guān)酶共同進(jìn)行抑制脂質(zhì)過氧化或終止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[22]，GSH 大量被消耗，抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。

圖2 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉GSH 含量、PAL 活性及木質(zhì)素含量的影響

PAL 活性高低控制著植物體內(nèi)多種次生酚類化合物、類黃酮植保素、木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成[23]。 從圖2B 可知，隨著煙葉成熟度增加，2 個(gè)品種煙葉PAL 活性均呈先上升后下降的變化趨勢，其峰值出現(xiàn)在尚熟(M2)時(shí)期。 這一結(jié)果正好與GSH 變化趨勢相反，說明尚熟階段是煙葉抗氧化最為激烈的時(shí)期。

木質(zhì)素是植物中常見的非酶促抗氧化活性物質(zhì)，可有效抵御微生物侵襲，提高植物的非酶促抗氧化能力[24]。 由圖2C 可知，隨著成熟度增加，煙葉木質(zhì)素含量從欠熟(M1)到適熟(M3)階段緩慢增加，適熟(M3)時(shí)達(dá)到高峰，之后開始急劇下降，過熟(M4)時(shí)含量最低。 說明煙葉過熟階段木質(zhì)素分解速率大于積累速率，煙葉非酶促抗氧能力減弱。

2.3 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉干鮮比的影響

煙葉干鮮比值是表征植物進(jìn)行有機(jī)物積累的重要指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)起著重要作用[25]。 由圖3 可以看出，隨著煙葉成熟度增加，2個(gè)品種的葉干鮮比均在適熟(M3)期之前逐漸上升，之后則明顯下降。 成熟時(shí)期不同，2 個(gè)品種干物質(zhì)積累速率也有所不同，適熟(M3)階段德雪3號(hào)煙葉干鮮比高于德雪5 號(hào)，其它成熟階段德雪5 號(hào)煙葉干鮮比又高于德雪3 號(hào)。 表明不同成熟階段品種間煙葉干鮮比存在明顯差異，進(jìn)而反映了煙葉生物積累量的差異。

圖3 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉干鮮比的影響

2.4 雪茄煙葉抗氧化特性指標(biāo)間及其與干物質(zhì)積累指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表2 可知，煙葉干鮮比與大多數(shù)抗氧化特性指標(biāo)呈顯著或極顯著性相關(guān)。 PAL 活性與POD 活性、MDA 含量、木質(zhì)素含量、干鮮比均呈極顯著正相關(guān)，與GSH 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與CAT 活性相關(guān)不顯著。 這說明PAL 對(duì)煙葉抗氧化系統(tǒng)及干物質(zhì)積累有重要影響，即煙株在遭受活性氧侵害時(shí)，苯丙烷類代謝被激活，PAL 活性上升，抗氧化能力增強(qiáng)，干物質(zhì)積累加快。

表2 煙葉抗氧化特性指標(biāo)間及其與干物質(zhì)積累指標(biāo)間的相關(guān)性

GSH 含量與木質(zhì)素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MDA 含量、葉干鮮比均呈顯著負(fù)相關(guān)，與CAT、POD 活性間的負(fù)相關(guān)未達(dá)到顯著水平。 這表明GSH 含量可以表征細(xì)胞非酶促抗氧化能力、膜脂過氧化水平及煙葉干物質(zhì)含量積累。 MDA 含量與POD 活性、木質(zhì)素含量均呈極顯著正相關(guān)，表明細(xì)胞膜脂過氧化水平與非酶促抗氧化途徑間存在協(xié)同作用。 POD 活性、CAT 活性、木質(zhì)素含量與葉干鮮比呈極顯著正相關(guān)，表明煙葉干物質(zhì)積累與酶促、非酶促抗氧化特性指標(biāo)間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。

2.5 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量的影響

由表3 可知，德雪3 號(hào)和德雪5 號(hào)煙葉總糖、還原糖含量隨著成熟度增加呈先增加后降低趨勢，最大值均出現(xiàn)在適熟(M3)階段。 2 個(gè)品種煙葉煙堿含量隨成熟度增加而增加，過熟(M4)時(shí)達(dá)到最大值，總氮、鉀含量則均隨成熟度增加而降低，欠熟(M1)時(shí)最高。 煙葉氯含量呈先降低后增加趨勢。

表3 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量的影響

化學(xué)成分比值是評(píng)價(jià)煙葉內(nèi)在化學(xué)成分協(xié)調(diào)性的重要指標(biāo)。 2 個(gè)品種煙葉氮堿比均隨成熟度增加而持續(xù)降低，鉀氯比呈先升后降的單峰變化趨勢。 糖堿比與鉀氯比的變化趨勢較為一致，其中德雪3 號(hào)適熟(M3)時(shí)最高，德雪5 號(hào)尚熟(M2)時(shí)最高。

綜合來看，適熟(M3)時(shí)采收，2 個(gè)品種煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量及其比值較為協(xié)調(diào)，煙葉品質(zhì)最優(yōu)。

2.6 不同成熟度對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響

由表4 可知，隨著成熟度的提高，煙葉感官評(píng)吸質(zhì)量均呈先上升后下降的變化趨勢，質(zhì)量得分峰值處在適熟(M3)階段。 但不同質(zhì)量指標(biāo)隨煙葉成熟度的變化而變化的規(guī)律性明顯不同，其中，適熟煙葉香氣質(zhì)最好，香氣量大，勁頭足，余味干凈舒適，回甜感強(qiáng)。 處理間比較，總體質(zhì)量以適熟(M3)煙葉最佳，尚熟(M2)、過熟(M4)煙葉次之，欠熟(M1)最差。

表4 不同成熟度對(duì)雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響

3 討論與結(jié)論

煙葉成熟是CAT、POD 等抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵酶活性功能下降、活性氧積累及膜脂過氧化作用不斷加強(qiáng)的過程[26]。 本研究表明，2 個(gè)雪茄煙品種適熟(M3)時(shí)采收的煙葉能夠保持較強(qiáng)的抗氧化活力、細(xì)胞生理代謝活動(dòng)正常，過熟(M4)時(shí)煙葉抗氧化能力明顯下降，細(xì)胞膜系統(tǒng)嚴(yán)重受損，甚至死亡。 這與王寧等[27]的研究結(jié)果相一致。

還原型谷胱甘肽(GSH)含量過高會(huì)導(dǎo)致其在機(jī)體內(nèi)過量積累，引起氧化損傷，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用[28]。 木質(zhì)素的合成與PAL 活性的增加呈正相關(guān)，細(xì)胞中的PAL 活性在木質(zhì)化之前迅速上升，而細(xì)胞壁的PAL 活性在木質(zhì)化期間快速增加[29]。 本研究發(fā)現(xiàn)，無論是德雪3 號(hào)還是德雪5號(hào)，從尚熟(M2)到適熟(M3)階段，煙葉PAL 活性下降，GSH、木質(zhì)素含量增加。 這說明適熟(M3)階段是煙葉生理功能走向衰老的關(guān)鍵時(shí)期，也是抗氧化能力最高水平時(shí)期[11]。 過熟(M4)煙葉表現(xiàn)為GSH 含量上升，PAL 活性及木質(zhì)素含量快速下降，表明煙葉機(jī)體自身氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡被打破，膜結(jié)構(gòu)和功能受到傷害。 這與Ueno 等[30]的研究結(jié)果相吻合。

干物質(zhì)積累作為直接影響煙葉產(chǎn)量的指標(biāo)，其含量受煙葉成熟度影響較大。 成熟期是煙葉進(jìn)行碳氮代謝和干物質(zhì)積累的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)煙葉產(chǎn)量、質(zhì)量有重要影響[31]。 本研究表明，由欠熟(M1)到適熟(M3)階段，煙葉干物質(zhì)積累速率明顯加快，之后快速下降。 這說明隨著煙葉逐漸成熟衰老，煙葉葉綠體腫脹、類囊體解體，光合能力下降，進(jìn)而干物質(zhì)積累速率和生物量降低。 這與闞洪贏[32]的研究結(jié)果相似，表明適時(shí)采收有利于干物質(zhì)積累和產(chǎn)量質(zhì)量的形成。

常規(guī)化學(xué)成分是衡量煙葉內(nèi)在質(zhì)量的核心內(nèi)容，其含量高低隨煙葉成熟度的變化而隨之發(fā)生變化。 一般認(rèn)為，優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉常規(guī)化學(xué)成分適宜范圍為總糖2%左右、總氮4%～6%、煙堿2.8%～3.8%、鉀≥2%、氯0.3%～0.6%、鉀氯比≥6[33]。本研究結(jié)果顯示，雪茄煙葉總糖、還原糖含量以適熟(M3)期含量最高。 其原因可能是生理成熟期(M2)到適熟采收期(M3)，煙葉的光合作用相對(duì)較強(qiáng)且碳水化合物如淀粉、總糖等物質(zhì)積累最多，而到過熟(M4)階段煙葉淀粉等大分子物質(zhì)又發(fā)生降解而產(chǎn)生小分子物質(zhì)，糖類物質(zhì)積累下降，這與尹啟生等[34]研究結(jié)果相一致。 本試驗(yàn)中，德雪3 號(hào)和德雪5 號(hào)煙葉總糖和還原糖含量普遍偏低，這一方面可能是由于雪茄煙葉調(diào)制過程較長，糖類物質(zhì)損耗較多，另一方面可能與四川省雪茄煙打頂時(shí)期較早、種植密度過高有關(guān)[35]。 煙堿是雪茄煙的特色成分和重要質(zhì)量特征指標(biāo)，在德雪3 號(hào)和德雪5 號(hào)煙葉中隨成熟度增加而增多，但均低于2.8%，可能與煙堿自身發(fā)生降解、轉(zhuǎn)化有關(guān)[36]。 煙葉鉀含量在成熟過程中一直呈下降趨勢，其原因可能是隨著成熟度增加，鉀離子向其它部位運(yùn)輸、損失較大，因而造成煙葉鉀離子含量較低[37]。 煙葉氯離子含量隨著成熟度增加呈先下降再上升的變化趨勢，總氮含量則隨成熟度增加而下降。 這與趙銘欽等[38]的研究結(jié)果相吻合。

感官質(zhì)量是評(píng)價(jià)煙葉質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。 本研究表明，隨著成熟度增加，煙葉從M1 到M3 階段，其感官質(zhì)量持續(xù)提高，到過熟(M4)階段煙葉質(zhì)量明顯變差。 表明適熟期煙葉發(fā)育充分，干物質(zhì)積累處于高峰，香氣物質(zhì)分解、轉(zhuǎn)化充分，煙葉質(zhì)量特征得到充分體現(xiàn)，風(fēng)格特征得到充分彰顯。

綜上所述，隨著煙葉成熟進(jìn)程的延伸和后期衰老程度的加劇，活性氧(ROS)清除酶的活性、能力下降，葉片逐漸走向衰老。 從欠熟(M1)到適熟(M3)階段，煙葉CAT 和POD 活性較高，膜脂過氧化水平較低，且PAL 活性和木質(zhì)素含量均較高，干物質(zhì)積累速率加快，調(diào)制后煙葉的常規(guī)化學(xué)成分含量平衡、協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量逐漸升高。 從適熟(M3)到過熟(M4)階段，煙葉的抗氧化能力急劇下降，膜系統(tǒng)有關(guān)的代謝活動(dòng)紊亂，光合作用受阻，物質(zhì)轉(zhuǎn)化趨向于以氧化分解為主，向著煙葉質(zhì)量變差的方向發(fā)展。 較當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)成熟(M2)期采收，德雪3 號(hào)、德雪5 號(hào)雪茄煙葉適熟(M3)期采收，有利于煙葉抗氧化特性提升和煙葉品質(zhì)提高。