朱砂煙和普通烤煙煙葉酚類物質差異分析

齊奎元，趙華武，金江華，張瑞平，張曉平，劉鵬飛，李玉娥

(1. 河南農業大學煙草學院/國家煙草栽培生理生化研究基地，河南鄭州 450002；2. 云南中煙工業有限責任公司，云南昆明 650231；3. 吉林煙草工業有限責任公司，吉林延吉 133001)

朱砂煙是優良煙株在自然生長發育過程中發生自然變異的結果，其煙葉中煙堿大量轉化為去甲基煙堿，正常調制后葉面特征顯著，呈現“櫻桃色”斑塊。 有研究認為，紅色斑塊是煙葉中多酚氧化產物在降煙堿作用下產生的“櫻紅”色素[1]；也有學者認為朱砂煙葉上的紅色物質是由去甲基煙堿和醌類物質反應而形成，其具體化學結構至今尚未確定[2，3]。 煙草中酚類物質含量是生物合成機制的結果，近年來研究表明煙葉中的酚類化合物作為煙草品質重要影響因素之一，對煙葉色澤、煙草香味和吃味有顯著影響[4-9]。 煙葉酚類物質按照羥基數目的不同，可分為簡單酚類和多酚。 簡單酚類含量極微，而多酚含量較高。 現已發現的煙草多酚類化合物包括單寧類、香豆素類、黃酮類、花色素類、簡單酚類衍生物等。 綠原酸、蕓香苷和莨菪葶是煙草中多酚化合物的主要成分，約占煙草中酚類物質含量的80%以上[10]，其中綠原酸是改善煙葉等級最主要的多酚類物質[11]。

煙葉在烘烤和調制過程中，非酶促棕色化反應會影響其外觀質量，調制后的干煙葉在貯存、陳化及發酵過程中，酶促棕色化反應會形成醌類聚合物類物質，使煙葉由黃色逐漸加深，變為紅色、棕色以至棕褐色[12]。 曹建敏等[13]研究表明，煙葉顏色是影響煙葉多酚含量的主要因素，葉片顏色越趨于紅棕色，黃酮類物質含量越低，莨菪葶含量越高。 黃酮類物質是煙草中多酚類次生代謝產物，也是影響煙草品質的重要潛香型物質[9，14]。黃酮類化合物在煙葉調制、醇化和燃燒過程中可氧化分解，賦予煙草優雅的清香氣味，并增加香氣量，對煙草制品品質有重要的改善作用。 成熟煙葉中黃酮體糖苷含量較高，通過裂解和降解等方式得到醇類和呋喃類等香味物質，可降低苦澀味，使吸味更加醇和[10]。 蕓香苷和綠原酸在煙草生長、調制和燃燒過程中發生多種化學反應，對煙草香味有直接影響，同時蕓香苷和綠原酸含量與煙葉等級有關，其在酶的作用下，易形成淡紅色至黑褐色的醌類物質及其聚合物，影響煙葉顏色[15]。

目前對朱砂煙酚類物質方面的研究鮮有報道。 本研究采用福林-酚法、蘆丁法、高效液相色譜法和氣相色譜法分析朱砂煙和普通煙葉及其卷煙煙氣中酚類物質成分，通過解析朱砂煙酚類物質成分，探索朱砂煙葉特征性紅色斑塊與酚類物質的相關性，分析朱砂煙與普通烤煙酚類物質之間的差異，以期為朱砂煙的選用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料:供試煙葉為2021 年云南省曲靖市采收的中上部烤后朱砂煙(云煙97 變異種)、普通烤煙云煙97 及朱砂煙葉上紅色斑塊。

試劑:甲醇為色譜純，二氯甲烷、福林-酚試劑、苯酚、沒食子酸、蘆丁等其它試劑均為分析純，均購自天津市大茂化學試劑廠。

儀器:Agilent 7890B-5977A 氣相色譜質譜聯用儀(Agilent Technologies 產品)；LC-20AR 高效液相色譜儀(日本島津公司產品)；UV-5200 紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司產品)；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet Co 產品)；SML 2000 直線型多通道吸煙機(中國科學院合肥物質科學院合肥眾沃儀器有限公司產品)。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 總酚類物質的測定 各測定環節如下:

(1) 標準溶液和樣品的制備:準確稱取0.1000 g焦性沒食子酸，用蒸餾水溶解并定容至1000 mL，沒食子酸標準溶液濃度為100 μg/mL。準確稱取6 份0.1 g 煙樣(過100 目篩)，置于50 mL 錐形瓶內，分別加入50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇(分析純)水溶液，超聲萃取20 min 后靜置過濾并定容至50 mL。 取1 mL 提取液使用Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀進行全波譜掃描，表明用60%甲醇(分析純)水溶液提取的樣品在340 nm 處吸光度較大，提取的酚類物質較多。 因此采用60%甲醇對樣品進行提取，提取液備用。

(2)福林比色法條件考察:參照王治同等[16]的方法并進行適當修改。

10%碳酸鈉溶液用量的確定:準確量取0.5 mL 沒食子酸標準溶液6 份于6 支20 mL 試管中，均加入福林-酚試劑1.5 mL，待充分混合后再分別加入10%碳酸鈉溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 mL，之后用蒸餾水補至20 mL，混勻后避光反應，使用UV-5200 紫外分光光度計每30 min 在760 nm 處測定吸光度，以確定福林-酚試劑與碳酸鈉溶液的最佳用量比。

福林-酚試劑用量的確定:準確量取0.5 mL沒食子酸標準溶液5 份于5 支20 mL 試管中，分別加入福林-酚試劑1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，待充分混合后，加入10%碳酸鈉溶液4.0 mL，其它條件不變，以確定福林-酚試劑用量對顯色效果的影響。

反應溫度及時間的確定:準確量取0.5 mL 樣品溶液4 份于4 支20 mL 試管中，分別加入福林-酚試劑2.0 mL，待充分混合后，加入10%碳酸鈉溶液4.0 mL，之后用蒸餾水補至20 mL，搖勻后靜置，避光反應，分別于25、35、45、55℃恒溫水浴鍋中保溫，其它條件不變，觀察溫度變化對顯色效果的影響。

(3)標準曲線的建立:準確稱取0.100 g 沒食子酸粉末，用蒸餾水定容至1000 mL，得到濃度為100 μg/mL 的沒食子酸標準溶液。 分別準確量取0、0.25、0.50、0.75、1.25、1.50 mL 沒食子酸標準溶液于20 mL 試管中，加入福林-酚試劑2.0 mL，充分混合后再加入10% Na2CO3溶液4.0 mL，用蒸餾水定容后再25℃下避光靜置30 min，以不加樣品為空白，使用UV-5200 紫外分光光度計于760 nm 處測定其吸光度。

(4)樣品測定:分別量取上述制備樣品溶液0.5 mL，采用與“(3)標準曲線的建立”相同的方法測定樣品中總酚類物質含量。

1.2.2 多酚含量的測定 取上述備用溶液2 mL，經0.22 μm 的有機相濾膜過濾至色譜瓶，用LC-20AR 高效液相色譜儀測定烤煙樣品中的綠原酸、蕓香苷、莨菪葶等主要多酚類物質含量。 儀器參數:A 流動相為88%超純水、10%甲醇、2%乙酸，B 流動相為88%甲醇、10%超純水、2%乙酸，流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，檢測波長為340 nm。 時間程序:初始流量為15%，用3 min 升至30%，用15 min 升至60%并保持10 min，用1 min 升至100%。

1.2.3 黃酮類物質的測定 各測定環節如下:

(1)標準溶液的制備:準確稱取120℃溫度下干燥至恒重的蘆丁標準品20.00 mg，用50%甲醇溶解并定容至100 mL，即得到濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準液。

(2)標準曲線的建立:參照陳愛洋等[17]的方法進行適當調整。 分別吸取蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于5 個25 mL 比色管中，用50%甲醇均補至6 mL，再分別加入50 g/L 亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后靜置6 min 再加入100 g/L硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min 再加入200 g/L 氫氧化鈉溶液5 mL，用蒸餾水定容后搖勻并靜置15 min，以空白樣為參比，使用UV-5200 紫外分光光度計在510 nm 處測定吸光度。 以吸光度為縱坐標，加入蘆丁試劑相對含量為橫坐標，建立標準曲線。

(3)樣品測定:取樣品儲備液3 mL，采用上述方法測定煙葉中黃酮類物質總含量。

1.2.4 煙氣中揮發性酚類物質的測定 各測定環節如下:

(1)卷煙樣品制備:煙葉經人工去除主脈后切絲(寬度0.8 mm)，卷制成重量為1±0.1 g 的評吸煙支，按GB/T 16447—2004《煙草及煙草制品調節和測試的大氣環境》要求調節煙支水分，每處理均制備10 支，使用SML 2000 直線型多通道吸煙機在標準吸煙條件下進行抽吸，并使用劍橋濾片收集。

(2)樣品前處理:采用乙酸苯乙酯為內標標準溶液，濃度為7.945 g/L。 將劍橋濾片置于50 mL 三角錐形瓶中，加入內標標準溶液50 μL 于濾片上，然后再加入甲醇20 mL，超聲萃取10 min，萃取液過0.45 μm 濾膜并定容至50 mL，移取1.5 mL 于色譜瓶中，使用Agilent 7890B-5977A 氣相色譜質譜聯用儀，按照工作條件進行測定。

(3)儀器條件:氣相條件:進樣口溫度設定為250℃；載氣為氦氣，純度大于99.999%，載氣流速為1 mL/min；采用分流進樣方式，分流比設定為10 ∶1；進樣量:1 μL。 程序升溫條件:初始溫度100℃，保持3 min， 以8℃/min 的速率升至155℃，保持8 min，再以20℃/min 的速率升至280℃，保持8 min。

離子源溫度為280℃；接口溫度為280℃；四極桿溫度為150℃；采用電子源轟擊(EI)電子源，電離能量為70 eV；傳輸線溫度設定為240℃；溶劑延遲設定為2 min；掃描方式為全掃描模式，掃描范圍為30 ～400 amu；MS 譜庫:NIST14.1；采用內標法定量。

1.2.5 感官質量評價 煙葉經人工去除主脈后切絲，卷制成重量為(1.0±0.1) g 的評吸煙支，按GB/T 16447—2004 要求調節煙支水分后進行感官質量評價。 由吉林中煙技術中心組織專家以YC/T 138—1998《煙草及煙草制品感官評價方法》為基礎，按單料煙“標度值”標準統一進行感官質量評吸鑒定，并采用“九分制”標準打分。

1.3 數據處理與分析

采用Origin 2021 軟件進行數據處理與作圖，SPSS 19.0 軟件進行統計分析，差異顯著性檢驗采用鄧肯氏法(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同烤煙樣品總酚類物質含量比較

2.1.1 檢測條件篩選 由福林-酚法原理可知，碳酸鈉溶液用量對多酚物質顯色有一定的影響。碳酸鈉溶液用量少會影響多酚物質的顯色，引起試驗誤差[18]。 圖1A 結果顯示，隨著10%碳酸鈉溶液用量增加，吸光度呈逐漸增加趨勢，加入量增至4.0 mL 時反應液的吸光度較大且穩定，再增加用量，吸光度變幅太大，且其過量下反應體系較為渾濁。 因此，10%碳酸鈉溶液用量選擇4.0 mL。

圖1 10%碳酸鈉不同用量(A)、福林-酚不同用量(B)和不同反應溫度(C)對反應體系吸光值的影響

由福林-酚法原理可知，福林-酚試劑與多酚類物質在堿性條件下呈藍色，福林-酚試劑用量會影響底物是否完全顯色[19]。 由圖1B 可知，福林-酚用量為2.0 mL 時，反應液顯色較為穩定且反應體系清澈、無碳酸鈉結晶，再增加用量雖然吸光度增大但不穩定。 因此，福林-酚試劑用量選擇2.0 mL。

由圖1C 可知，當溫度為25℃時，吸光度較大，隨著溫度的升高，吸光度逐漸下降。 因此反應溫度選擇25℃。

綜上，確定優化反應條件為:樣品溶液0.5 mL，加入福林-酚試劑2.0 mL，充分混合后再加入10%碳酸鈉溶液4.0 mL，并用蒸餾水定容至20 mL，于25℃下避光放置40 min，之后在760 nm 處檢測樣品的吸光度。 按該方法測定部分樣品并反應30～40 min 時吸光度較穩定，因此確定用此方法。

2.1.2 總酚類物質含量比較 由表1 可見，同部位烤煙樣品總酚類物質含量均存在顯著差異，上部葉總酚類物質含量均高于中部葉。 云煙97 上、中部葉總酚類物質含量均較低，朱砂煙處于中等水平，朱砂煙中紅色斑塊含量最高，且顯著高于云煙97 和朱砂煙。

表1 不同烤煙樣品總酚類物質含量

2.2 不同烤煙樣品主要多酚類物質含量比較

由表2 可知，不同部位煙葉之間主要多酚類物質含量差異較大，上部葉含量較高。 紅色斑塊總量處于最高水平，中、上部朱砂煙葉和紅色斑塊主要多酚類物質總量分別高出云煙9718.71%、22.76%和31.82%、41.95%。

表2 不同烤煙樣品主要多酚類物質含量 (mg/g)

就中部葉而言，綠原酸和蕓香苷含量各煙樣間差異均顯著，云煙97 綠原酸含量最低，紅色斑塊含量最高。 云煙97 與朱砂煙比較，莨菪葶含量差異不顯著，朱砂煙含量略高；紅色斑塊莨菪葶含量顯著高于云煙97 和朱砂煙。

上部煙葉中，云煙97、朱砂煙和紅色斑塊的綠原酸含量差異顯著，紅色斑塊綠原酸含量顯著高于朱砂煙和云煙97，云煙97 含量最低。 紅色斑塊莨菪葶含量最高，顯著高于云煙97 和朱砂煙，云煙97 莨菪葶含量最低，但與朱砂煙不存在顯著差異。 紅色斑塊蕓香苷含量最高，與云煙97差異顯著，朱砂煙與云煙97、紅色斑塊間均差異不顯著。

2.3 不同烤煙樣品黃酮類物質總量比較

通過全光譜掃描，確定黃酮類物質的反應體系在510 nm 處吸光度最大，因此使用紫外分光光度計檢測此處樣品中的黃酮類物質含量。 以蘆丁為標準品建立標準曲線:y ＝12x+0.0046，R2＝0.9992。由表3 可知，同部位煙葉之間黃酮類物質總量存在顯著性差異，且云煙97 含量均最低。 中部煙樣中，相比于云煙97，紅色斑塊黃酮類物質總量高出9.07%，朱砂煙含量顯著低于紅色斑塊。上部煙樣中，云煙97 黃酮類物質總量最低，朱砂煙和紅色斑塊含量比云煙97 分別高出6.45%、10.37%，紅色斑塊黃酮類物質總量處于最高水平。

表3 不同烤煙樣品黃酮類物質總量(mg/g)

2.4 不同烤煙樣品煙氣中揮發性酚類物質含量比較

酚類化合物是卷煙主流煙氣的主要組分之一，與卷煙的安全性和感官品質密切相關。 由表4 可知，同部位不同烤煙煙氣中揮發性酚類物質總量差異較大，上部葉明顯高于中部葉，朱砂煙上部葉該類總量最大，且其各酚類物質含量大多高于云煙97。 朱砂煙卷煙樣品煙氣中的苯酚、對苯二酚含量較高。

表4 不同烤煙樣品煙氣中揮發性酚類物質含量(μg/g)

2.5 不同烤煙樣品卷煙感官質量評價

由表5 可知，朱砂煙中、上部煙葉各感官質量評價指標均優于云煙97，其香氣質和香氣量較好，余味舒適，刺激性稍有，勁頭較低，燃燒性中等，灰分灰白，雜氣較輕。 同部位同等級煙葉中，朱砂煙葉感官質量綜合評分較高。

表5 不同烤煙樣品卷煙感官質量評價結果(分)

3 討論

3.1 福林-酚法優化

酚類物質結構上含有酚羥基，呈酸性或弱酸性，不溶于水，而碳酸鈉溶液呈弱堿性，因此需要控制碳酸鈉溶液用量及濃度，既能使其充分反應，又可以避免反應體系的不平衡；碳酸鈉溶液受溫度影響較大，溫度較低時會析出結晶、引起試驗誤差；多酚類物質受熱易分解，會導致測定結果偏低，因此要控制合適的溫度；顯色30 ～40 min 時，吸光度均已達到穩定。 通過對10%碳酸鈉溶液用量、福林-酚用量、反應溫度和反應時間的探索優化，確定福林-酚法測定條件的最優組合為:10%碳酸鈉溶液用量4.0 mL、福林-酚用量2.0 mL、反應溫度25℃、顯色時間40 min，這樣總酚的測定結果更加準確。

3.2 朱砂煙和普通烤煙酚類物質含量差異分析

本研究結果表明，不同烤煙樣品之間總酚類物質含量存在顯著性差異；同部位烤煙中，朱砂煙葉上紅色斑塊處總酚類物質含量最高，云煙97 略低于朱砂煙。

不同烤煙樣品間中部葉烤煙主要多酚類物質含量差異較大，綠原酸、蕓香苷含量均差異顯著。整體上朱砂煙葉主要多酚類物質含量相對較高，尤其是朱砂煙葉上紅色斑塊處。 煙葉調制過程中，酚類物質發生酶促和非酶促反應形成分子量較大的黃色、紅色以至棕褐色色素，影響煙葉的色澤[20]，這與朱砂煙獨特的色澤有極大關系。

上部葉烤煙中，不同烤煙樣品間綠原酸含量均有顯著性差異。 綠原酸是改善煙葉品質最主要的多酚類物質[10]。 朱砂煙與云煙97 的蕓香苷和莨菪葶含量不存在顯著性差異，與紅色斑塊的蕓香苷含量也沒有顯著性差異，與其莨菪葶含量相比顯著減少。

黃酮類物質為烤煙香氣的前體物質之一[9]。本研究表明，不同烤煙樣品黃酮類物質含量存在顯著性差異；同部位烤煙樣品中朱砂煙葉黃酮類化合物含量較高，顯著高于云煙97，顯著低于紅色斑塊。

朱砂煙葉特征性紅色斑塊的黃酮類物質含量和酚類物質含量最高，其形成原因可能是煙葉中酚類物質氧化成醌類或其它呈紅色的物質，也可能是黃酮類物質在氧化或調制、純化過程中形成的某種物質。

3.3 不同烤煙樣品煙氣中揮發性酚類物質含量差異分析

煙葉中酚類物質在卷煙抽吸時直接進入煙氣的量很少，煙氣中酚類物質主要來源于煙葉中多酚類物質的裂解；卷煙制品抽吸時會發生酸性反應，中和部分堿性，使吃味醇和，對卷煙制品的抽吸品質起著重要作用[21]，如2，6-二甲基苯酚具有增甜和增香的效果，苯酚具有甜味和藥物氣味。本試驗通過GC-MS 對煙草制品進行分析，結果顯示，同部位卷煙樣品中，朱砂煙的揮發性酚類物質總量較高。 揮發性酚類物質大都具有酚香氣，一些簡單酚對煙氣香吃味產生愉快的影響，其中苯酚、乙基酚、對乙烯基愈創木酚、2，5-二叔丁基苯酚對卷煙香氣和吃味有較好影響，而朱砂煙中這些揮發性酚類物質含量均較高，這將賦予朱砂煙獨特的香氣質、充足的香氣量和較好的吃味。

3.4 烤煙樣品感官質量分析

烤煙感官質量與酚類物質相關，酚類物質在卷煙燃燒時，通過熱裂解、中和等反應，使吃味更加醇和。 有研究表明，多酚類物質尤其是綠原酸，是改善煙草吸食品質的重要因素之一，與香氣質和香氣量呈顯著正相關[22，23]。 朱砂煙葉中酚類物質尤其是綠原酸含量較高，賦予其豐滿的香氣質和充足的香氣量。 焦天雷等[24]研究表明，相比于普通烤煙，香氣物質含量高可能是朱砂煙風味特征的物質基礎。 對煙草制品進行感官質量評價表明，朱砂煙葉整體質量較高，其卷煙香氣質較好、香氣量較足、吃味更加醇和，這與前人研究結果具有較高的一致性[25]。

4 結論

本研究確定的福林-酚法測定煙葉總酚含量的最優條件為:樣品用量0.5 mL，福林-酚試劑用量2.0 mL，充分混合后再加入10%碳酸鈉溶液4.0 mL，25℃下避光放置40 min，之后在760 nm 波長下測定樣品中總酚類物質含量。 朱砂煙總酚類物質、主要多酚類物質和黃酮類物質含量較高，且與云煙97 普通煙葉之間大多差異顯著，品質較高。不同烤煙樣品卷煙的揮發性酚類物質含量差異較大，朱砂煙各揮發性酚類物質含量較高，具有較好的香氣質和吃味，香氣量較足。 整體上看，朱砂煙較優。