氮磷鉀肥不同組合對植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

王曉宇，蘇夢迪，胡麗濤，李航，黃浪平，馬嘯，張松濤

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，河南鄭州 450002；2. 中國煙草總公司重慶市公司豐都分公司，重慶 408200)

微生物參與土壤團(tuán)聚體形成、養(yǎng)分循環(huán)、有機質(zhì)分解和生物防治等過程[1]。 施肥能在短時間內(nèi)提高土壤有效養(yǎng)分含量，并被微生物和植物吸收利用。 氮磷鉀肥的施用能提高植煙土壤的速效養(yǎng)分含量，降低土壤pH 值，并通過改變土壤理化性質(zhì)影響土壤細(xì)菌多樣性和豐富度，改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)煙草生長[2-4]。 氮磷鉀肥的施用對土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響不同。 Allison 和Martiny 的研究結(jié)果表明，施用氮磷鉀肥顯著影響細(xì)菌多樣性[5]。 氮肥施用提高了玉米田土壤細(xì)菌多樣性，而對番茄田土壤細(xì)菌多樣性幾乎無影響[6-8]。 隨著氮肥用量的增加，花生田土壤細(xì)菌多樣性和豐富度的變化趨勢表現(xiàn)為先升高后降低[9]。 研究發(fā)現(xiàn)，磷肥施用通過增加堿解氮和速效磷含量提高了黃土丘陵等土壤的細(xì)菌豐富度和多樣性，其中酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度提高，而變形菌門(Proteobacteria)相對豐度降低[3]。 隨著鉀肥用量的增加，細(xì)菌多樣性先升高后降低[10]。 施用鉀肥可降低植煙土壤的變形菌門(Proteobacteria)相對豐度，提高馬賽菌屬(Massilia)相對豐度[4]。 氮磷鉀不同組合對細(xì)菌多樣性影響也不同。 施用氮磷肥、磷鉀肥或氮磷鉀肥能夠提高細(xì)菌豐度和多樣性，而施用氮鉀肥則降低細(xì)菌多樣性[11，12]。

細(xì)菌多樣性的改變可影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和煙草生長。 酸桿菌門(Acidobacteria)能分解土壤中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，參與土壤氮循環(huán)[13]。 土壤氮轉(zhuǎn)化菌多樣性的提高促進(jìn)了土壤有機氮向無機氮的轉(zhuǎn)化，提高堿解氮、銨態(tài)氮及全氮含量[14]。鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)通過產(chǎn)生生長素促進(jìn)煙草種子萌發(fā)和幼苗生長[15]。 新洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cenocepacia)能提高煙草對磷素的吸收利用率，促進(jìn)煙草生長，改善其農(nóng)藝性狀[16]。 可見，施用氮磷鉀肥對植煙土壤化學(xué)性質(zhì)和煙草生長的影響研究較多，而氮磷鉀肥不同組合對植煙土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響機制尚不明確。 因此，本試驗以云煙116 為材料，研究分析氮磷鉀不同施肥組合對植煙土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，以期闡明氮磷鉀肥對土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響機制，為通過調(diào)控土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)提高煙草產(chǎn)質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本研究于2020 年4—8 月在重慶市豐都縣太平壩鄉(xiāng)(29°44＇N，108°9＇E)開展。 該地平均海拔1514 m，亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年均降水量1150 ～1350 mm，年均日照時數(shù)1050 h，無霜期平均265 d。試驗田為砂壤土，肥力中等，耕層土壤基本理化性質(zhì):堿解氮153 mg/kg、速效磷51.6 mg/kg、速效鉀342 mg/kg、pH 值5.0。

1.2 試驗材料

供試單質(zhì)肥料為硝酸銨(含N 35%)、重過磷酸鈣(含P2O543%)、硫酸鉀(含K2O 50%)。 供試品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙116(Nicotiana tabacumL. cv. Yunyan 116)。

1.3 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置5 個處理:CK(不施肥)、PK(磷鉀)、NK(氮鉀)、NP(氮磷)和NPK(氮磷鉀)。NPK 處理的供氮量為118.39 kg/hm2，供磷量為112.81 kg/hm2，供鉀量為399.38 kg/hm2。 按表1方案配比不同施肥處理，一次性施入。 試驗采取隨機區(qū)組設(shè)計，每處理3 次重復(fù)。 行距1.2 m，株距0.5 m。 小區(qū)面積66.7 m2，設(shè)保護(hù)行。 除施肥外，各處理其它田間管理措施相同。

表1 不同施肥組合肥料用量(kg/hm2)

1.4 農(nóng)藝性狀測定

在煙苗移栽后30、60、90 d，按照YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》調(diào)查煙草的葉長、葉寬、株高、莖圍和有效葉數(shù)，并計算葉面積(葉長×葉寬×0.6345)。

1.5 樣品采集與理化指標(biāo)測定

分別在煙苗移栽后30、60、90 d 采集土壤樣品。 選取長勢均勻一致的煙株，采用抖根取樣法收集煙草根際土壤用于微生物多樣性測定。 采集兩株煙中間位置5 cm 寬度、0～20 cm 深度的土壤樣品，在陰涼處干燥、磨碎后過0.85 mm 孔徑篩，用于土壤理化指標(biāo)測定[17]。 使用pH 酸度計測定土壤pH 值；采用堿解擴散法測定土壤堿解氮(alkaline hydrolysis nitrogen， AN)含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗顯色分光光度法測定土壤速效磷(available P， AP)含量；采用醋酸銨-火焰光度計法測定速效鉀(available K， AK)含量。

1.6 土壤DNA 提取、擴增與高通量測序

使用DNA 抽提試劑盒進(jìn)行土壤樣品基因組DNA 提取，以提取的DNA 為模板，使用引物343F(5＇ - TACGGRAGGCAGCAG - 3＇)、 789R (5＇ -AGGGTATCTAATCCT-3＇)對土壤細(xì)菌16S rRNA的V3 和V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴增。 PCR 反應(yīng)體系(25 μL): Tks Gflex DNA Polymerase(1.25 U/μL)0.6 μL，2×Gflex PCR Buffer 15 μL，DNA 模板50 ng (≥1 μL)，正、反引物(5 pmol/μL)各1 μL，最后加ddH2O 至25 μL。 PCR 擴增程序:95℃ 5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃20 s，7 個循環(huán)；72℃5 min。 委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行Miseq 文庫構(gòu)建和測序。 測序數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后使用Vsearch(version 2.4.2)軟件[18]按照97%的相似度進(jìn)行OTU 分類，采用RDP classifier Naive Bayesian 分類算法進(jìn)行比對注釋。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用最小顯著性差異法(LSD)和蓋姆斯-豪厄爾法(Games-Howell)進(jìn)行方差分析。 使用歐易云平臺(https:/ /cloud.oebiotech.cn/task/)進(jìn)行繪圖。使用Origin 2021 進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis， RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理土壤細(xì)菌α 多樣性

對移栽后30、60、90 d 不同施肥處理的45 個土壤樣品進(jìn)行測序共獲得3038 474 條有效序列，基于97%的序列相似度進(jìn)行聚類分析獲得16791個OTU，細(xì)菌覆蓋度在0.9717 ～0.9782 之間(表2)，說明測序深度包含了樣本中大部分細(xì)菌，測序數(shù)據(jù)合理。

表2 不同施肥處理對細(xì)菌群落α 多樣性指數(shù)的影響

不同施肥處理對土壤細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)影響程度不同(表2)。 移栽后30 d，施肥處理顯著提高了細(xì)菌的Chao1 指數(shù)和PD whole tree指數(shù)，而對Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無顯著影響。 移栽后60 d，施肥處理對細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)無顯著影響。 與NPK 處理相比，PK、NK和NP 處理顯著提高了細(xì)菌的PD whole tree 指數(shù)。 移栽后90 d，NK 處理顯著降低了細(xì)菌的Shannon 指數(shù)，而其它施肥處理對細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)無顯著影響。 該結(jié)果表明，施肥處理在移栽后30 d 對細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)影響較大，而在移栽后60、90 d 的影響較小。 因此，本研究選擇移栽后30 d 的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 不同施肥處理土壤細(xì)菌OTU 分布

不同施肥處理對細(xì)菌群落OTU 影響不同(圖1)。 移栽后30 d 不同施肥處理和CK 的OTU 總數(shù)為9462 個，共有OTU 數(shù)為1837 個，占總數(shù)的19.41%。 PK、NK、NP、NPK 和CK 的OTU 總數(shù)分別為5360、4702、4678、4780、4168 個，特有OTU 數(shù)分別為1024、761、696、747、502 個；與CK相比，PK、NK、NP、NPK 差異OTU 數(shù)分別為2483、1916、1909、2095 個，分別占總OTU 數(shù)的46.32%、40.75%、40.81%、43.83%。 以上結(jié)果表明，施肥處理增加了細(xì)菌群落OTU 總數(shù)，改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖1 不同施肥處理土壤細(xì)菌OTU 韋恩圖(移栽后30 d)

2.3 土壤細(xì)菌群落主成分分析

移栽后30 d 不同施肥處理的土壤細(xì)菌群落主成分分析(PCA)表明，PC1 軸和PC2 軸對樣本組成差異的貢獻(xiàn)率分別為39.2%、34.1%，其中，CK 主要位于第二象限，PK、NK 和NPK 位于第四象限，NP 主要位于第一象限(圖2A)。 結(jié)果表明，不同施肥處理與CK 的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。 其中，NP 處理與其它施肥處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖2 土壤細(xì)菌群落主成分分析

不同取樣時期的細(xì)菌群落PCA 表明，PC1 軸和PC2 軸對樣本組成差異的貢獻(xiàn)率分別為19.2%、17.5%。 其中，移栽后60、90 d 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較小，而移栽后30 d 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大(圖2B)，該結(jié)果與細(xì)菌群落α 多樣性分析結(jié)果一致。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.4.1 細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組成分析 不同施肥處理對細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組成影響如圖3 所示。 移栽后30 d，15 個土壤樣品中細(xì)菌可歸為15個門類。 其中，相對豐度大于1%的優(yōu)勢門類為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，其相對豐度之和占所有可注釋細(xì)菌門類的98.41%～99.15%。 不同施肥處理提高了放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)等優(yōu)勢門類的相對豐度，而降低了變形菌門(Proteobacteria)相對豐度。 施氮處理NK、NP 和NPK 的厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度高于不施氮處理PK 和CK，而變形菌門(Proteobacteria)相對豐度則低于PK 處理和CK(圖3A)。

圖3 門水平上細(xì)菌群落相對豐度

移栽后不同時期施肥處理對部分優(yōu)勢菌門相對豐度影響如圖3B ～E 所示。 移栽后30 d，施肥處理提高了酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度，而降低了變形菌門(Proteobacteria)相對豐度。 移栽后60、90 d，施肥處理降低了酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度。移栽后30、60、90 d，施氮處理NK、NP 和NPK 的變形菌門(Proteobacteria)相對豐度呈先升高后降低的趨勢，不施氮處理PK 和CK 則呈逐漸降低的趨勢。 施肥處理的放線菌門(Actinobacteria)相對豐度呈逐漸降低的趨勢。

2.4.2 細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)組成分析 不同施肥處理對屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成影響如圖4 所示。 移栽后30 d，15 個土壤樣品中細(xì)菌在屬水平上可歸為15 個屬類。 其中，優(yōu)勢屬包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、 羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、朱氏桿菌屬(Chujaibacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Granulicella、伯克氏菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)，其相對豐度之和占所有可注釋細(xì)菌屬類的24.77%～28.37%。 不同施肥處理提高了羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、朱氏桿菌屬(Chujaibacter)、Granulicella和苔蘚桿菌屬(Bryobacter)的相對豐度，降低了新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)和馬賽菌屬(Massilia)相對豐度。 施氮處理NK、NP和NPK 的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、伯克氏菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)相對豐度低于不施氮處理PK 和CK。

圖4 屬水平上細(xì)菌群落相對豐度

移栽后30、60、90 d，施氮處理NK、NP 和NPK 的羅河桿菌屬(Rhodanobacter)和朱氏桿菌屬(Chujaibacter)相對豐度高于不施氮處理PK 和CK，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度則低于PK 和CK。 施肥處理的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和羅河桿菌屬(Rhodanobacter)相對豐度總體呈逐漸降低的趨勢；NPK 處理的朱氏桿菌屬(Chujaibacter)相對豐度分別為2.35%、10.89%、1.72%，NP 處理的馬賽菌屬(Massilia)相對豐度分別為0.98%、1.85%、0.60%。

2.5 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化因子的關(guān)聯(lián)分析

移栽后30 d 細(xì)菌優(yōu)勢門水平相對豐度的RDA 分析(圖5A)表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對細(xì)菌優(yōu)勢門水平相對豐度的差異解釋度分別為89.49%、7.99%，影響優(yōu)勢門水平相對豐度的土壤理化因子依次為pH＞AN＞AP ＞AK。 酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度與AP 和AK 含量呈正相關(guān)，與pH 值呈負(fù)相關(guān)；變形菌門(Proteobacteria)相對豐度則與pH 值呈正相關(guān)，與AN、AP 和AK 含量呈負(fù)相關(guān)。 細(xì)菌優(yōu)勢屬水平的RDA 分析(圖5B)表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對細(xì)菌優(yōu)勢屬水平相對豐度的差異解釋度分別為76.08%、16.46%，影響細(xì)菌優(yōu)勢屬水平相對豐度的土壤理化因子依次為pH＞AP＞AN＞AK。 朱氏桿菌屬(Chujaibacter)和羅河桿菌屬(Rhodanobacter)相對豐度與AN 含量呈正相關(guān)，與pH 值呈負(fù)相關(guān)。 鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和馬賽菌屬(Massilia)相對豐度則與AN含量呈負(fù)相關(guān)，與pH 值呈正相關(guān)。 馬賽菌屬(Massilia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和朱氏桿菌屬(Chujaibacter)相對豐度與AP 含量呈正相關(guān)，羅河桿菌屬(Rhodanobacter)相對豐度與AP含量呈負(fù)相關(guān)。 以上結(jié)果表明，pH、堿解氮、速效磷和速效鉀對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，其中pH、堿解氮和速效磷是主要影響因子。

圖5 土壤優(yōu)勢細(xì)菌與理化因子的RDA 分析(移栽后30 d)

2.6 土壤細(xì)菌多樣性與煙草農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

移栽后30 d 土壤細(xì)菌多樣性與煙草農(nóng)藝性狀的Heatmap 關(guān)聯(lián)分析表明，土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)和優(yōu)勢門、屬類相對豐度與煙株葉面積的關(guān)聯(lián)度較高，其次為有效葉數(shù)(圖6)。 α 多樣性指數(shù)Chao1 和PD whole tree 與煙株葉面積、莖圍呈顯著或極顯著正相關(guān)，說明土壤細(xì)菌豐富度和多樣性的提高能夠增加煙株葉面積和莖圍。 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中優(yōu)勢門與煙草農(nóng)藝性狀的指標(biāo)關(guān)聯(lián)度較高。 其中，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度與煙草葉面積呈顯著或極顯著正相關(guān)，而擬桿菌門(Bacteroidetes)和Dependentiae 相對豐度與煙草葉面積呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。 細(xì)菌優(yōu)勢門類與煙草株高無顯著相關(guān)性。 放線菌門(Actinobacteria)相對豐度與煙草莖圍呈顯著正相關(guān)。 綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度與煙草有效葉數(shù)呈顯著正相關(guān)，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和Dependentiae 相對豐度與煙草有效葉數(shù)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。 細(xì)菌優(yōu)勢屬苔蘚桿菌屬(Bryobacter)相對豐度與煙株葉面積、株高、莖圍和有效葉數(shù)呈極顯著或顯著正相關(guān)。 馬賽菌屬(Massilia)相對豐度與煙株葉面積呈極顯著負(fù)相關(guān)，Ramlibacter屬相對豐度與煙株葉面積、株高和有效葉數(shù)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。 以上結(jié)果表明，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與煙草的生長關(guān)系密切。

圖6 細(xì)菌多樣性指數(shù)、優(yōu)勢門屬與煙草農(nóng)藝性狀指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析(移栽后30 d)

3 討論

3.1 施肥對土壤細(xì)菌多樣性的影響

細(xì)菌具有轉(zhuǎn)化土壤養(yǎng)分、降解難溶物質(zhì)和促進(jìn)作物生長的功能[19]。 細(xì)菌對土壤環(huán)境變化較敏感，易受到土壤理化性質(zhì)的影響，施肥通過改變土壤養(yǎng)分和pH 值影響細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)[3]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，施肥可以提高土壤速效養(yǎng)分含量[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)，施肥對移栽后30 d 土壤細(xì)菌多樣性和豐富度影響較大，提高了細(xì)菌多樣性和豐富度。 土壤養(yǎng)分可以為細(xì)菌提供營養(yǎng)從而直接影響細(xì)菌多樣性，尤其是參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的功能菌[9，10]。 放線菌門(Actinobacteria)具有分解幾丁質(zhì)、纖維素和脂類等難降解有機物的功能。 芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)能將糖分子轉(zhuǎn)化為維生素，參與調(diào)節(jié)土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)[21，22]。 放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度與土壤速效磷和速效鉀含量呈正相關(guān)，二者都屬于富營養(yǎng)型細(xì)菌。此外，土壤養(yǎng)分也能改變土壤理化性質(zhì)和作物生長來間接影響細(xì)菌多樣性[23，24]。 細(xì)菌多樣性和豐富度指數(shù)與煙草農(nóng)藝性狀呈顯著或極顯著正相關(guān)。 因此，施肥可能通過提高土壤養(yǎng)分增加細(xì)菌多樣性和豐富度， 進(jìn)而促進(jìn)煙草的生長發(fā)育[14，25]。

3.2 施肥對土壤細(xì)菌優(yōu)勢門類的影響

pH 值是改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子[26，27]。 施肥通過改變土壤pH 值影響細(xì)菌門水平上的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響煙草的生長發(fā)育。 本研究發(fā)現(xiàn)，施肥提高了酸桿菌門(Acidobacteria)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)等門的相對豐度，降低了變形菌門(Proteobacteria)相對豐度，且土壤pH值顯著影響變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度。 關(guān)聯(lián)分析表明，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對煙草農(nóng)藝性狀影響顯著。 前期研究發(fā)現(xiàn)，施肥能降低土壤pH 值，提高土壤速效養(yǎng)分含量[20]。 變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌具有解磷功能，能促進(jìn)作物地下部的生長和對土壤養(yǎng)分的吸收，適宜在中性環(huán)境中生長，pH 值降低不利于其生長[25，28]。 酸桿菌門(Acidobacteria)屬于反硝化菌，能分解土壤中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，適宜在酸性環(huán)境中生長，其相對豐度與pH 值呈顯著負(fù)相關(guān)(土壤pH＜5.5 時)[14]。 因而，施肥可能通過降低土壤pH 值減少變形菌門(Proteobacteria)相對豐度，增加酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度。放線菌門(Actinobacteria)具有解磷和促進(jìn)作物生長的功能，還能產(chǎn)生多種抗菌素抑制病原菌的繁殖[29，30]。 RDA 分析表明，pH 值與放線菌門(Actinobacteria)相對豐度呈負(fù)相關(guān)，pH 值降低可使放線菌門(Actinobacteria)相對豐度增加，促進(jìn)煙草的生長發(fā)育。 藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)具有光合固氮及溶解磷酸鹽的作用，施肥可能通過增加藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)相對豐度提高土壤堿解氮和速效磷含量，從而參與土壤氮循環(huán)和磷素轉(zhuǎn)化[31]。

3.3 施肥對屬水平功能菌的影響

施肥通過改變土壤速效養(yǎng)分影響了細(xì)菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)。 土壤堿解氮和速效磷是改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子[24，31]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，PK 處理提高土壤速效磷含量，施氮處理NK、NP和NPK 提高土壤堿解氮含量[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)，施肥改變了細(xì)菌屬水平功能菌的相對豐度，土壤速效磷和堿解氮對細(xì)菌屬水平功能菌的相對豐度影響較大。 鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)細(xì)菌具有解磷功能，能通過分解難降解有機物適應(yīng)營養(yǎng)缺乏的環(huán)境[32]。 因此，PK 處理可能通過提高速效磷含量增加解磷菌鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的相對豐度。 苔蘚桿菌屬(Bryobacter)細(xì)菌具有解磷功能，參與土壤磷循環(huán)，并能分解纖維素和木質(zhì)素等有機物[33]。 施肥處理除了提高土壤速效磷含量、促進(jìn)煙草生長發(fā)育外，還提高苔蘚桿菌屬(Bryobacter)相對豐度。 關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，苔蘚桿菌屬(Bryobacter)相對豐度與煙草農(nóng)藝性狀相關(guān)指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。 因此，苔蘚桿菌屬(Bryobacter)可能在土壤速效磷促進(jìn)煙草生長發(fā)育的過程中起著重要作用，與煙草的生長發(fā)育緊密相關(guān)。 本研究還發(fā)現(xiàn)施肥處理提高土壤速效磷含量[20]，促進(jìn)煙草生長，降低Ramlibacter屬相對豐度。Ramlibacter屬相對豐度與煙草農(nóng)藝性狀呈顯著負(fù)相關(guān)。Ramlibacter屬細(xì)菌具有多種磷酸酶活性，能促進(jìn)土壤中磷酸鹽的生成和磷酯的水解。磷酯是重要的磷儲庫，磷酯水解能釋放大量正磷酸鹽，促進(jìn)土壤中的礦物沉淀[34]。 因此，施肥可能通過提高土壤速效磷含量降低Ramlibacter屬相對豐度，從而促進(jìn)煙草生長。 馬賽菌屬(Massilia)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)和伯克氏菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia)均屬于反硝化細(xì)菌[35，36]。 因此，氮肥的施用可能通過降低這些反硝化細(xì)菌的相對豐度來提高土壤堿解氮含量[37]。 此外，馬賽菌屬(Massilia)相對豐度與煙草農(nóng)藝性狀呈極顯著負(fù)相關(guān)。 因此，氮肥的施用可能通過降低反硝化細(xì)菌的相對豐度來提高土壤堿解氮含量，促進(jìn)煙草生長發(fā)育。慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)細(xì)菌具有固氮功能，氮肥施用會通過提高土壤堿解氮含量抑制該菌屬細(xì)菌的固氮酶活性，不利于其生長代謝，這可能是導(dǎo)致慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)相對豐度降低的原因[38]。 芽孢桿菌屬(Bacillus)具有解磷和解鉀功能，有利于植物根系生長，能產(chǎn)生生長素、抗菌素等多種代謝物，其外泌的靶毛蛋白能上調(diào)煙草的水楊酸和乙烯合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，激發(fā)煙草免疫防御反應(yīng)，提高煙草對生物和非生物脅迫的抗性[39-41]。 因此，NK 處理可能通過增加土壤速效鉀含量提高解鉀菌芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對豐度。 綜上，施肥通過改變土壤速效養(yǎng)分影響土壤細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)菌的相對豐度，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

氮磷鉀肥不同組合對移栽后30 d 土壤細(xì)菌多樣性影響較大，施肥提高了土壤細(xì)菌多樣性和豐富度，改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。 在門水平上，施肥提高酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度，降低變形菌門(Proteobacteria)相對豐度。 在屬水平上，施用氮肥降低馬賽菌屬(Massilia)和固氮菌慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)等反硝化菌的相對豐度，施用磷鉀肥提高解磷菌鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的相對豐度。 此外，施肥通過改變土壤pH 值和速效養(yǎng)分影響了細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，其中土壤pH 值、堿解氮和速效磷是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子。 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化與煙草生長密切相關(guān)，其中苔蘚桿菌屬(Bryobacter)對煙草農(nóng)藝性狀影響較大。 因此，氮磷鉀肥不同組合通過改變土壤pH值、堿解氮和速效磷含量影響細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，尤其是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)菌的相對豐度，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)調(diào)節(jié)，從而影響煙草生長發(fā)育。