3 種核桃寄主對云斑天牛腸道可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響

林葉邦，徐蕾，楊振德，3，韋善方

(1. 廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西南寧 530000；2. 欽州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西欽州 535000；3. 廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；4. 巴馬瑤族自治縣自然資源局核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，廣西巴馬 547500)

鐵核桃(Juglans sigillataDode)屬胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)植物，別名漾濞核桃、泡核桃等，主要分布在我國西南地區(qū)，為我國原產(chǎn)樹種[1]。 鐵核桃為優(yōu)質(zhì)的食用油原料，耐濕熱不耐干旱，抗寒力弱，品種類型繁多，堅(jiān)果大小和形狀多種多樣，品質(zhì)優(yōu)良，能夠滿足多種育種目標(biāo)的需要[2]。 細(xì)香核桃(J.sigillatacv. ‘Xixiang’)、龍佳核桃(J.sigillatacv. ‘Niangqing’×J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’)和娘青核桃(J.sigillatacv. ‘Niangqing’)均屬鐵核桃，具有較大的深加工價(jià)值，市場前景良好[3-5]。 云斑天牛(Batocera lineolata)屬鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)昆蟲，主要寄主有核桃(Juglans regis)、桉樹(Eucalyptus robusta)、楊樹(Populus tomentosa)、桑樹(Morus alba)等，廣泛分布于我國廣東、廣西、湖南、貴州、四川等多個(gè)省份和自治區(qū)[6]，對我國林業(yè)生態(tài)環(huán)境建設(shè)的發(fā)展造成嚴(yán)重影響，目前已經(jīng)被定為高度危險(xiǎn)性林業(yè)有害生物[7]。 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西河池市多個(gè)縣的核桃林出現(xiàn)了云斑天牛，對核桃樹造成毀滅性傷害[8]。

昆蟲體內(nèi)存在大量微生物[9]。 研究表明，腸道微生物在昆蟲的多種生命活動(dòng)中都有參與，提高了昆蟲的生態(tài)適應(yīng)和生存能力[10]。 昆蟲腸道微生物與宿主的相互作用主要體現(xiàn)于參與宿主食物消化、補(bǔ)給養(yǎng)分、提高宿主抗逆性以及影響宿主的壽命和繁殖能力[11-14]。 微生物在昆蟲克服寄主防御中發(fā)揮重要作用，如紅脂大小蠹(Dendroctonus valensLeConte)腸道細(xì)菌可以幫助昆蟲降解寄主油松(Pinus tabuliformisCarrière)的單萜[15]；玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgiferaLeConte)腸道細(xì)菌可以促進(jìn)其對玉米(Zea mays)和非寄主大豆(Glycine max)輪作的適應(yīng)力[16]；桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybe invasa)部分伴生細(xì)菌可降解桉樹次生代謝物質(zhì)來幫助小蜂克服植物抗性完成定殖等[17]。 許多研究表明，不同寄主植物會(huì)影響昆蟲腸道微生物多樣性，比如:桉樹枝癭姬小蜂分別取食巨園桉DH 201-2 和窿緣桉后體內(nèi)細(xì)菌群落豐富度和多樣性存在明顯差異[18]；桃小食心蟲(Carposina sasakiiMatsumura)在不同果園取食蘋果和梨后，寄主植物和生境能夠顯著影響該蟲的腸道菌群[19]。 為了探究不同寄主植物對云斑天牛腸道可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響，本研究以云斑天牛成蟲為材料，利用傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)與16S rDNA 序列分析相結(jié)合的方法，對分別取食3種不同品種核桃后云斑天牛腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，為進(jìn)一步研究云斑天牛腸道微生物菌群與寄主防御機(jī)制的相互關(guān)系及為選育對云斑天牛具有優(yōu)良抗性的核桃優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試細(xì)香核桃、龍佳核桃和娘青均為1 年生嫁接苗，從廣西河池市金城江區(qū)東江鎮(zhèn)木友村(108°4＇E，24°45＇N)各取10 株，種植于廣西大學(xué)林學(xué)院教學(xué)實(shí)踐基地(108°17＇E，22°51＇N)。 砧木來源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣漾江鎮(zhèn)(99°56＇E，25°47＇N)，細(xì)香接穗來源于云南省保山市昌寧縣柯街鎮(zhèn)扁瓦村(99°31＇E，24°50＇N)，龍佳接穗來源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣馬廠鄉(xiāng)馬廠村馬廠林場(99°59＇E，25°40＇N)，娘青接穗來源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治縣太平鄉(xiāng)太平村(99°52＇E，25°37＇N)。

試驗(yàn)用云斑天牛成蟲采自廣西河池市巴馬瑤族自治縣核桃種植基地(107°15＇E，24°9＇N)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照胡建軍等[20]的人工接蟲方法。 將16 目鐵絲網(wǎng)裁剪成60 cm × 50 cm 大小，在核桃樹基部圍成一個(gè)高約40 cm 的籠子，然后將云斑天牛成蟲放入籠中用鐵絲將籠子封嚴(yán)，1 個(gè)籠中放1 只云斑天牛，取食7 天，每個(gè)品種做3 個(gè)重復(fù)。

1.3 云斑天牛腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與純化

試驗(yàn)前饑餓處理48 h，排空體內(nèi)食物殘?jiān)Ｔ诔瑑艄ぷ髋_(tái)內(nèi)將成蟲完全浸泡于75%乙醇中5 min 進(jìn)行體表消毒，之后用濾紙吸干表面殘余液體，解剖出腸道移至玻璃勻漿器中加5 mL 無菌水，研磨充分后制成云斑天牛腸道勻漿液。

將制備好的腸道勻漿液按照10 倍梯度稀釋方法制成10-1～10-7不同濃度的菌液，通過平板劃線法在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，得到單一菌落后把帶菌平板送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA 測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站的GenBank 上進(jìn)行BLAST 比對分析，將測序菌株鑒定至屬。 將各菌株相對應(yīng)Blast 結(jié)果中一致性最高的菌株序列下載，利用MEGA 11.0 軟件中Neighbor-Joining(NJ)法(bootstrap 設(shè)置為1000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種核桃對云斑天牛成蟲腸道細(xì)菌組成的影響

利用LB 培養(yǎng)基，從取食3 種核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離得到19 株可培養(yǎng)細(xì)菌。 NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果(表1)表明，從取食龍佳核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出可培養(yǎng)細(xì)菌5 株，分屬于5 個(gè)屬，分別是拉烏爾菌屬(Raoultella)、腸球菌屬(Enterococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)；從取食娘青核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出可培養(yǎng)細(xì)菌7 株，分屬于7 個(gè)屬，分別是拉烏爾菌屬、腸球菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)和泛菌屬(Pantoea)；從取食細(xì)香核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出可培養(yǎng)細(xì)菌7 株，分屬于7 個(gè)屬，分別是拉烏爾菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、Gibbsiella屬、泛菌屬和假單胞菌屬。

表1 云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定

將3 組云斑天牛成蟲腸道分離得到的菌屬繪制成韋恩圖，結(jié)果(圖1)表明，這些菌屬中有3 個(gè)屬是共有的，取食娘青和細(xì)香核桃的云斑天牛分別分離出1 種特有菌屬。

圖1 取食不同核桃品種的云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)韋恩圖

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對測序得到的云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。 結(jié)果表明，LJ1-9 菌株屬于厚壁菌門，LJ1-12、LJ3-8、LJ3-13和LJ1-11 菌株屬于變形菌門(圖2)；NQ1-18 和NQ2-2 菌株屬于厚壁菌門，NQ1-2、NQ2-9、NQ2-7、NQ2-17 和NQ1-20 菌株屬于變形菌門(圖3)； XX2-13 菌株屬于厚壁菌門，XX1-9、XX1-7、XX3-4、XX1-13、XX3-17 和XX2-4 菌株屬于變形菌門(圖4)。 表明變形菌門是取食3 種核桃后云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌群。

圖2 基于16S rDNA 序列取食龍佳核桃后云斑天牛成蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 基于16S rDNA 序列取食娘青核桃后云斑天牛成蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖4 基于16S rDNA 序列取食細(xì)香核桃后云斑天牛成蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，取食3 個(gè)品種核桃的云斑天牛成蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌在門分類水平上均為變形菌門和厚壁菌門，且變形菌門為優(yōu)勢菌門。眾多研究表明，大部分鱗翅目與鞘翅目昆蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌均屬于變形菌門和厚壁菌門，推測它們可能在昆蟲的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。 在小菜蛾[Plutella xylostella( L.)][21]、仁扇舟蛾(Clostera restitura)[22]、松褐天牛(Monochamus alternatus)[23]、桑天牛(Apriona germari)[24]、新西蘭助翅鰓金龜(Costelytra zealandica)[25]等昆蟲腸道中的可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢菌門也均為變形菌門，證明不同昆蟲之間的腸道可培養(yǎng)細(xì)菌種類存在一定的相似性。

食物為昆蟲體內(nèi)微生物多樣性的重要影響因子之一[26]。 本研究發(fā)現(xiàn)取食不同核桃的云斑天牛成蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的組成存在明顯差異。 取食龍佳核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出的菌屬最少；取食娘青核桃和細(xì)香核桃的云斑天牛分離出來的菌屬數(shù)量相等，但在菌屬組成上存在差異。已有研究表明，一些植物的次生代謝物質(zhì)，如丹寧[27]、黃酮[28]和一些酚類物質(zhì)[29]等均會(huì)對細(xì)菌的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，因此推測造成取食不同寄主植物的云斑天牛腸道可培養(yǎng)菌屬組成存在差異的原因是不同寄主植物的次生代謝物質(zhì)的含量存在差別。

在本研究中，拉烏爾菌屬、腸球菌屬和克雷伯氏菌屬為3 個(gè)處理中的共有菌屬，這3 個(gè)屬可能對維持取食核桃的云斑天牛成蟲的生理代謝活動(dòng)具有特殊影響。 相對于取食娘青核桃和細(xì)香核桃的云斑天牛來說，取食龍佳核桃的云斑天牛成蟲腸道未分離出假單胞菌屬和泛菌屬菌株。 有研究指出從感染潰瘍病的獼猴桃組織中分離出假單胞菌屬菌株[30，31]；從感染核桃細(xì)菌性黑斑病的組織中分離出泛菌屬菌株[32]，表明這兩個(gè)屬中存在植物致病菌，本次研究分離出來的假單胞菌屬和泛菌屬的菌株對取食寄主是否有致病力還需進(jìn)一步研究。 取食細(xì)香核桃的云斑天牛成蟲腸道中分離出來特有菌屬Gibbsiella，目前國內(nèi)對該菌的研究較少。 周會(huì)先等[33]對普氏蹄蝠(Hipposideros pratti)進(jìn)行腸道細(xì)菌多樣性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了Gibbsiella屬細(xì)菌的存在，他提出普氏蹄蝠胃腸道中存在的大部分細(xì)菌屬于致病菌，且對人類與動(dòng)物有害，因此推測Gibbsiella屬細(xì)菌也是屬于致病菌的一種；此外在取食桉樹的云斑天牛幼蟲腸道中也分離出該屬菌株[34]。 在國外研究中，從有樹皮裂紋等病害癥狀的栓皮櫟(Quercus roburL.)中分離出了Gibbsiella屬細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)該菌與急性櫟樹衰退(AOD)有關(guān)[35]；伊朗也發(fā)現(xiàn)了一種新的櫟樹(Quercusspp.)病害，發(fā)現(xiàn)Gibbsiella菌是與櫟樹莖出血癥和潰瘍病有關(guān)的潛在致病菌[36]；伊朗西北部爆發(fā)的一種核桃新發(fā)疾病，經(jīng)鑒定為Gibbsiella quercinecans引起的核桃細(xì)菌性潰瘍病[37]。 至于該菌是天牛腸道中的共生菌還是通過取食寄主后進(jìn)入到體內(nèi)的、在天牛腸道中起到什么作用、Gibbsiella屬細(xì)菌的具體功能等還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，不同核桃寄主植物能夠?qū)υ瓢咛炫３上x腸道細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生影響，這些細(xì)菌是否能夠?qū)υ瓢咛炫５纳顒?dòng)產(chǎn)生影響及是否會(huì)對寄主植物造成二次傷害，還有待后續(xù)研究。