達格列凈對高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞MKP-1表達的影響及意義

王麗暉,黃旭東,汪晶華,張 超,史永紅,楊新軍

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一,在國外該病是導致慢性腎功能衰竭的首位原因。隨著我國糖尿病發(fā)病率的升高,DN也逐漸成為國內慢性腎功能衰竭的主要原因之一。有研究表明,多種細胞因子參與DN的發(fā)病過程,結締組織生長因子(CTGF)在DN早期腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質蛋白過度分泌過程中具有一定作用[1]。在高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞CTGF的表達受p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調節(jié)[2]。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)作為p38 MAPK磷酸化的調控因子,如何在腎小球系膜細胞CTGF表達和細胞外基質蛋白分泌過程中發(fā)揮作用,越來越受到研究人員關注[3]。MKP-1如何調節(jié)CTGF表達和系膜細胞分泌細胞外基質蛋白,目前尚無定論[4]。鈉-葡萄糖共運蛋白2(SGLT2)抑制劑是一種新型降糖藥物,還能夠降低DN患者蛋白尿、延緩慢性腎功能衰竭的發(fā)生[5]。但是SGLT2抑制劑對DN保護作用的具體機制尚不清楚。本實驗觀察SGLT2抑制劑達格列凈對高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞MKP-1表達的影響及機制,明確MKP-1與CTGF表達和細胞外基質蛋白分泌的關系,以期為達格列凈治療DN提供更充足的理論基礎和臨床證據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

達格列凈(粉劑)由阿斯利康醫(yī)藥科技(北京)有限公司饋贈。北京中杉金橋生物技術有限公司負責辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG和羊抗兔IgG進口分裝。兔抗大鼠MKP-1、CTGF多克隆抗體、SB203580購自Santa Cruz公司;兔抗大鼠p38 MAPK和兔抗小鼠p-p38 MAPK購自美國Cell Signaling Technology;RT-PCR試劑盒購自Promega公司;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Milipore公司;細胞上清液中CTGF和纖維連接蛋白(FN)的ELISA檢測試劑盒購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司;Ⅳ型膠原放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術研究所有限公司。

1.2 系膜細胞培養(yǎng)及分組

大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞株購自武漢大學保藏中心,采取常規(guī)復蘇、胰酶消化法進行傳代培養(yǎng)。首先將細胞分為4組,正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng))、滲透壓對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng))、高糖組(30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng))、達格列凈干預組(30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L達格列凈培養(yǎng))。各組細胞均干預48 h后收集細胞,應用相應方法提取系膜細胞的蛋白質和RNA,同時將細胞上清液收集到EP管中待測。

1.3 達格列凈對系膜細胞增殖影響

取對數生長期的系膜細胞,經胰酶消化后,吹打成單細胞懸液,接種于96孔板中,按照分組進行干預,觀察4組培養(yǎng)12、24、48 h系膜細胞增殖情況。另外,觀察不同濃度(0、1、10和20 μmol/L)達格列凈分別與30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h后,系膜細胞的增殖情況。干預結束的各組細胞中加入MTT試劑(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后分別加入DMSO,使用酶標儀觀察波長490 nm各組的吸光度值。實驗重復3次,取平均值。

1.4 Western blotting檢測相關蛋白表達

用冷PBS液將系膜細胞洗2遍,隨后加入細胞裂解液,進行冰浴、離心操作。取樣本50 μg,采用Lowry法測定蛋白濃度,8% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜。加入MKP-1、CTGF、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗體,稀釋比例為1∶200,4 ℃過夜。再次洗膜操作后分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000稀釋)。洗膜,加ECL試劑。Western blotting檢測條帶采用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LICOR公司)掃描,定量分析采用LabWorks 4.5(美國UVP公司),測定其吸光度值。

1.5 RT-PCR檢測

采用Trizol試劑提取系膜細胞總RNA,總RNA含量和純度應用紫外分光光度儀測定。cDNA合成應用逆轉錄酶催化。在Taq DNA聚合酶作用下以適量cDNA為模板進行擴增。擴增過程主要包括:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性50 s進入循環(huán),58 ℃和56.9 ℃分別為退火溫度,作用時間為60 s,72 ℃延伸8 min,循環(huán)30次。對擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,應用美國UVP公司生產的凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析,對電泳結果進行吸光度掃描。用目的基因與GAPDH吸光度的比值來表示各基因的相對表達量。不同基因引物序列見表1。

1.6 細胞上清液CTGF和細胞外基質蛋白測定

收集系膜細胞上清液,應用ELISA試劑盒檢測CTGF和FN含量,應用放射免疫法檢測Ⅳ型膠原的含量,檢測步驟嚴格按試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 達格列凈對系膜細胞增殖的影響

與正常對照組比較,高血糖組培養(yǎng)12、24、48 h系膜細胞增殖程度增強(P<0.05,P<0.01)。與高糖組比較,達格列凈干預組培養(yǎng)24和48 h系膜細胞的增殖程度減弱(P<0.05)。見表2。0、1、10和20 μmol/L達格列凈分別與30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h后,系膜細胞吸光度值分別為0.642±0.031、0.437±0.021、0.456±0.023和0.445±0.022。與0 μmol/L達格列凈比較,1、10和20μmol/L達格列凈干預能減弱系膜細胞增殖程度(P<0.05)。

表2 4組系膜細胞不同時間點細胞增殖狀況比較

2.2 達格列凈對MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達的影響

與正常對照組比較,高糖組MKP-1蛋白表達降低,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表達升高(P<0.01)。與高糖組比較,達格列凈干預組MKP-1蛋白表達升高,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表達降低(P<0.05)。4組p38 MAPK蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表3。

1.正常對照組;2.滲透壓對照組;3.高糖組;4.達格列凈干預組;正常對照組采用5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),滲透壓對照組采用5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng),高糖組采用30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),達格列凈干預組采用30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L達格列凈培養(yǎng);MKP-1為絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1,CTGF為結締組織生長因子,MAPK為絲裂原活化蛋白激酶。圖1 達格列凈對系膜細胞MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達的影響

表3 4組系膜細胞MKP-1、CTGF、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達比較

2.3 達格列凈對系膜細胞CTGF和FN mRNA表達的影響

正常對照組、滲透壓對照組、高糖組和達格列凈干預組CTGF mRNA表達分別為0.21±0.02、0.22±0.02、0.78±0.24和0.59±0.02;FN mRNA表達分別為0.22±0.03、0.24±0.02、0.81±0.18和0.56±0.11。與正常對照組比較,高糖組CTGF和FN mRNA表達明顯升高(P<0.05)。與高糖組比較,達格列凈干預組CTGF和FN mRNA表達明顯降低(P<0.05)。見圖2。

1.正常對照組;2.滲透壓對照組;3.高糖組;4.達格列凈干預組;正常對照組采用5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),滲透壓對照組采用5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng),高糖組采用30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),達格列凈干預組采用30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L達格列凈培養(yǎng);CTGF為結締組織生長因子,FN為纖維連接蛋白;與正常對照組比較,①P<0.05;與高糖組比較,②P<0.05。圖2 RT-PCR檢測4組系膜細胞CTGF和FN mRNA表達

2.4 達格列凈對細胞上清液CTGF及細胞外基質蛋白含量的影響

與正常對照組比較,高糖組細胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量明顯增加(P<0.01)。與高糖組比較,達格列凈干預組細胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 4組系膜細胞上清液中CTGF和細胞外基質蛋白含量比較

3 討論

DN早期腎小球處于高灌注、高濾過狀態(tài),與之相對應的病理改變是腎小球體積增大、系膜細胞數量及細胞外基質蛋白分泌增多,隨著病程的延長,最終導致腎小球硬化[5-7]。CTGF作為促纖維化因子,能夠在糖尿病早期的細胞外基質蛋白分泌增多和晚期的腎臟纖維化過程中發(fā)揮作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn),CTGF mRNA在DN早期腎小球中表達增強,提示其參與了腎小球體積增大和細胞外基質蛋白分泌增多的過程[9]。另外,也有研究發(fā)現(xiàn),DN大鼠腎小管上皮細胞CTGF表達增強,表明CTGF能夠在DN腎小管增生和腎間質纖維化中發(fā)揮作用[10]。本實驗在高糖狀態(tài)下體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞,觀察到細胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量均明顯增加,同時伴有系膜細胞CTGF蛋白和mRNA表達增強,提示高糖刺激可以通過增強CTGF蛋白和mRNA表達,進一步促進系膜細胞分泌細胞外基質蛋白。這與其他報道結果一致[11],表明高糖狀態(tài)下CTGF表達的增加或與高糖、糖基化終末產物、高壓力、腎素-血管緊張素Ⅱ信號轉導通路激活等有關。

p38 MAPK信號轉導通路在高糖等因素刺激下,可使體外培養(yǎng)的系膜細胞CTGF表達上調,細胞外基質蛋白分泌增加[12]。抑制p38 MAPK信號轉導通路能夠影響系膜細胞的增殖狀態(tài),使CTGF表達和細胞外基質蛋白分泌減少,從另一個側面提示了p38 MAPK信號轉導通路參與了高糖狀態(tài)下CTGF表達和細胞外基質蛋白分泌[13]。本實驗結果顯示,高糖能使系膜細胞p38 MAPK的磷酸化水平增高,但MKP-1蛋白表達降低。由于MKP-1位于細胞核內,是MAPK的天然負性調節(jié)因子,對MAPK的去磷酸化發(fā)揮重要作用[14]。雙特異性蛋白激酶磷酸化可以激活MAPK調節(jié)位點中保守的蘇氨酸或酪氨酸基團,使其去磷酸化,從而使MAPK活性下降。所以,活化的MAPK在MKP-1作用下發(fā)生去磷酸化過程,導致活性下降。MKP-1的特異性選擇底物是MAPK家族中的蛋白激酶,主要包括p38 MAPK、ERK1/2和JNK[15]。本實驗結果顯示,高糖狀態(tài)下p38 MAPK可以作為MKP-1的底物,在MKP-1的作用下,去磷酸化過程減弱,p38 MAPK的活性增強,參與CTGF的表達和細胞外基質蛋白的分泌過程。以往實驗發(fā)現(xiàn),高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞MKP-1蛋白表達明顯下降,而MKP-1 mRNA表達水平無明顯變化,提示高糖并不能使MKP-1蛋白生成減少,但可致MKP-1蛋白降解增加[16]。本研究結果顯示,與正常對照組比較,高糖組MKP-1蛋白表達降低,p-p38 MAPK蛋白表達明顯升高,提示高糖狀態(tài)下CTGF表達增強可能與MKP-1蛋白表達降低,p38 MAPK磷酸化增強,p38 MAPK活化有關。

SGLT2抑制劑是一種新型降糖藥物,通過抑制腎臟近曲小管對葡萄糖的重吸收,使葡萄糖在尿液中的排泄增加,從而發(fā)揮降血糖作用[17-18]。另外,SGLT2抑制劑還具有腎臟保護作用,可以降低蛋白尿的發(fā)展和腎功能惡化的風險,其機制包括控制血壓、降低腎小球內壓和超濾、改變炎癥過程、減輕腎臟纖維化及缺血相關的腎臟損傷等[19-21]。有實驗研究表明,應用恩格列凈治療雄性db/db小鼠10周后,可以減輕FN和Ⅳ型膠原蛋白在腎小管的聚集,降低腫瘤轉化因子、CTGF以及腎臟損傷分子-1、中性粒細胞明膠酶的表達[22],提示恩格列凈可以減輕糖尿病小鼠腎組織的損傷和纖維化。在臨床試驗中,與格列美脲比較,卡格列凈300 mg/d組血漿腫瘤壞死因子受體1、白細胞介素-6、基質金屬蛋白酶7和FN1均明顯降低,表明卡格列凈可降低糖尿病患者血液中的纖維化因子[23]。上述研究均提示SGLT2抑制劑能減輕糖尿病患者腎組織細胞外基質聚集,降低纖維化因子表達,延緩腎臟纖維化進程。但SGLT2抑制劑對高糖狀態(tài)下系膜細胞的作用如何,報道少見。本研究結果顯示,與高糖組比較,達格列凈干預組MKP-1蛋白表達升高,CTGF和p-p38 MAPK蛋白表達降低,細胞上清液CTGF、FN和Ⅳ型膠原含量降低,提示達格列凈可能通過增加MKP-1蛋白表達,使p38 MAPK去磷酸化水平增強,從而降低p38 MAPK活性,減少CTGF蛋白表達和細胞外基質蛋白分泌。進一步表明達格列凈降低CTGF表達可能是通過增強MKP-1蛋白表達,抑制p38 MAPK信號轉導通路實現(xiàn)的。

綜上所述,達格列凈可以有效抑制高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞CTGF表達和細胞外基質蛋白分泌,可能與激活MKP-1后,增強p38 MAPK去磷酸化有關。