長鏈非編碼RNA LINC02178對膀胱癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響及機制研究

盧保德, 韋柳興, 李鎮杰, 林志弟, 黃勇平

(右江民族醫學院附屬醫院 泌尿外科, 廣西 百色, 533000)

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤,據全球癌癥協會[1]統計, 2020年膀胱癌新發病例為57.3萬例,死亡病例為21.2萬例,其發病率和致死率均呈上升趨勢。復發和轉移是患者死亡的常見原因,研究膀胱癌增殖、轉移的分子機制,尋找新的潛在治療靶點,對膀胱癌的防治有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA, 在細胞增殖、分化、蛋白修飾等方面發揮重要作用[2], 是近年來腫瘤學研究的熱點。LINC02178是新近發現的lncRNA, 在多種腫瘤中異常表達。SUN Z L等[3]基于公共數據庫分析發現, LINC02178可能參與膀胱癌細胞自噬,并與患者預后不良相關。本研究在公共數據庫分析的基礎上,結合分子生物學實驗研究LINC02178對膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響,并初步探討其分子機制,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細胞系J82、T24、5637、SV-HUV-1均購自中國科學院上海細胞庫; Trizol購自天根公司; TransStart?Green qPCR SuperMix購自北京全式金公司; LINC02178引物由上海生工公司合成; 胎牛血清購自Gibco公司; DMEM培養基購自Hyclone公司; Lipofectamine2000購自Invitrogen公司; Transwell小室購自Corning公司; siRNA-LINC02178和陰性對照系列由湖州河馬生物公司設計合成,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)等抗體均購自北京安諾倫公司。

1.2 方法

1.2.1 LINC02178在公共數據庫中的分析: 在腫瘤與癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中下載414例膀胱癌患者的RNAseq和臨床病理、生存數據。采用R語言的基礎R包、ggplot2包分析LINC02178在膀胱癌中的表達及其與臨床病理特征的關系。采用R語言的survival包分析LINC02178與膀胱癌患者生存預后的關系,并繪制生存曲線。

1.2.2 細胞培養和轉染: 膀胱癌細胞系T24、J82、5637和正常膀胱上皮細胞SV-HUV-1細胞采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基進行培養,培養條件為37 ℃、5%CO2的相對飽和濕度。取對數生存期的J82細胞,采用Lipofectamine2000將LINC02178干擾系列和陰性對照系列轉染至細胞中,將細胞分為si-LINC02178組和si-NC組。

1.2.3 逆轉錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LINC02178表達水平: 取各膀胱癌細胞系及經不同處理的各組細胞(si-LINC02178組、si-NC組、T24、J82、5637、SV-HUV-1)培養48 h, 采用胰酶消化,提取總RNA, 檢測純度合格后,按照試劑盒說明書逆轉錄合成互補DNA(cDNA), -20 ℃保存備用。以cDNA為模板,進行實時熒光定量PCR, LINC02178上游引物為5′-GAGGGAGCCGAGGCAGTTTC-3′, 下游引物為5′-GAGGTCCTGTACCGAGGGGG-3′;GAPDH上游引物為5′-GCGGGGCCTCTCCAGAACATC-3′, 下游引物為5′-ACTGACACGTTGGCAGTGGG-3′; 反應條件為95 ℃下35 s預變性, 95 ℃變性10 s, 60 ℃延伸35 s, 擴增38個循環,采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.4 噻唑藍(MTT)實驗檢測細胞增殖: 將轉染si-LINC02178組、si-NC組J82細胞繼續培養48 h后,將細胞接種到96孔板中,待細胞貼壁后,各組細胞在0、24、48、72 h時,每孔加MTT溶液20 μL, 在培養箱中孵育4 h。采用酶標儀測定各孔光密度值(OD值),以時間為橫坐標,以450 nm處OD值(OD450 nm)為縱坐標,繪制細胞生長曲線。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移: 取各組細胞培養48 h, 胰酶消化,離心收集細胞,換無血清培養基培養,制備單細胞懸液,密度為3×105個/mL。將300 μL調好密度的細胞懸液加入上室中,下室加500 μL全培養基,培養48 h, 采用4%多聚甲醛固定20 min, 棉簽擦去上室中的細胞,結晶紫室溫染色10 min, 沖洗掉多余染料, 100倍顯微鏡拍照,計算各孔穿過膜的細胞數量。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲: 將基質膠適當稀釋,平鋪于上層小室,放入37 ℃培養箱中凝固,出現“白色層”后取出小室,其他步驟同1.2.5。

1.2.7 Western blot實驗: si-LINC02178和si-NC組擴大培養,收集對數生長期細胞,采用RIPA緩沖液裂解細胞,提取蛋白,采用BCA試劑盒測定蛋白濃度,隨后通過凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上; 采用濃度為5%的脫脂奶粉封閉2 h, 洗膜2次,加入一抗, 4 ℃孵育過夜; 再次洗膜3次后,加入二抗,室溫孵育2 h后,化學發光法檢測蛋白表達水平,以GAPDH為內參蛋白。

1.3 統計學方法

采用SPSS23.0和R3.6.3軟件進行分析, GraphPad Prism7.0軟件制圖。采用Kaplan-Meier法分析LINC02178表達與膀胱癌生存預后的關系。計量資料采用均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗,計數資料采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LINC02178在膀胱癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

TCGA數據庫分析結果顯示, LINC02178在膀胱癌組織中的表達高于膀胱正常組織,差異有統計學意義(P<0.05)。以中位數為臨界值,分為LINC02178高表達和低表達患者,結果顯示LINC02178表達與臨床病理T分期相關(P<0.05), 見表1。生存分析顯示, LINC02178高表達患者生存預后相較低表達患者更差,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

表1 LINC02178表達與臨床病理特征關系

A: LINC02178在膀胱癌中的表達; B: LINC02178與膀胱癌預后的關系。圖1 LINC02178在膀胱癌組織中的表達及與預后的關系

2.2 LINC02178在膀胱癌細胞中的表達

LINC02178在膀胱癌細胞系J82、T24、5637中相對表達量分別為(2.13±0.01)、(1.84±0.03)、(1.73±0.04), 均高于SV-HUV-1細胞中的LINC02178表達量,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2。因LINC02178在J82細胞中表達最高,故選用J82細胞進行下一步的研究。

2.3 轉染后細胞中LINC02718的表達

轉染后si-LINC02718組J82細胞LINC02718的表達量為(0.23±0.01), 低于si-NC組,差異有統計學意義(P<0.05), 說明細胞中LINC02178的表達被有效抑制。見圖3。

與si-NC組比較, ???P<0.001。圖3 LINC02178在J82細胞敲低效率驗證

2.4 沉默LINC02178對細胞增殖的影響

沉默LINC02178后, si-NC組48 h細胞活性OD值為(0.79±0.01), si-LINC02178組為(0.61± 0.02), 差異有統計學意義(P<0.05); si-NC組72 h細胞活性OD值為(1.21±0.02), si-LINC02178組為(0.86±0.03), 差異有統計學意義(P<0.05), 說明抑制LINC02178表達后,膀胱癌細胞增殖速度減慢。見圖4。

與si-LINC02178組比較, ??P<0.01, ???P<0.001。圖4 沉默LINC02178后細胞增殖曲線

2.5 沉默LINC02178后對細胞侵襲的影響

Transwell結果顯示, si-NC組侵襲細胞數為(179.30±4.26)個, si-LINC02178組為(91.33±2.02)個,差異有統計學意義(P<0.05), 說明沉默LINC02178后細胞侵襲能力減弱。見圖5。

與si-NC組比較, ???P<0.001。圖5 沉默LINC02178后細胞侵襲能力變化

2.6 沉默LINC02178后對細胞遷移的影響

遷移實驗顯示, si-LINC02178組細胞遷移數目為(98.33±3.84)個, si-NC組為(196.30±2.73)個,差異有統計學意義(P<0.05), 說明沉默LINC02178后細胞遷移能力下降。見圖6。

與si-NC組比較, ???P<0.001。圖6 沉默LINC02178后細胞遷移能力變化

2.7 沉默LINC02178后對PI3K/Akt信號通路的影響

沉默LINC02178后, si-NC組和si-LINC02178組中PI3K、Akt蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05); si-LINC02178組中磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表達水平低于si-NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

與si-NC組比較, ??P<0.01, ???P<0.001。圖7 沉默LINC02178表達后的蛋白表達變化

3 討 論

膀胱癌在泌尿系腫瘤中發病率高,其中75%為非肌層浸潤膀胱癌, 25%為肌層浸潤性膀胱癌[4-5]。膀胱根治性切除是肌層浸潤性膀胱癌治療的金標準,但有約50%的患者會出現局部復發或遠處轉移,發生轉移的患者大部分在2年內死亡[6], 其主要原因是現有的化療方案針對進展或轉移的晚期膀胱癌患者的治療效果有限,缺乏高效的靶向藥物[7]。因此,尋找新型分子標志物,研究其進展、轉移的分子機制,對改善膀胱癌的診治方式以及降低死亡率有重要的意義。

研究[8]顯示lncRNA是一類無編碼蛋白質功能的RNA分子,但在機體中發揮重要的生物學功能,尤其是在腫瘤的發生、發展過程中[9]。多項研究[10-11]發現lncRNA能參與調控惡性腫瘤的增殖、轉移、凋亡等生物學功能, lncRNA的異常表達與多種腫瘤的病理分期、預后相關,有望成為腫瘤診斷、預后及靶向治療的新標志物[12-13]。研究[14]發現lncRNA UCA1表達上調可促進膀胱癌細胞增殖和遷移,對膀胱癌具有較高的臨床輔助診斷價值,可作為膀胱癌預后不良的標志物[15-16]。研究[17]發現lncRNA H19在多種癌癥中異常表達, H19表達失調可通過多種機制影響癌癥生物學,被認為是癌癥的生物標志物和潛在治療靶點[18]。LINC02178是新近發現的非編碼RNA,在腫瘤中的研究較少。PAN J F等[19]基于LUSC數據庫構建肺癌預后相關的lncRNA風險模型,發現LINC02178可作為預測肺腺癌預后的標志物,指導患者的個體化治療。SUN Z L等[3]利用TCGA數據庫中膀胱癌患者數據進行分析,發現LINC02178與膀胱癌自噬相關,且與患者總生存期存在顯著相關性。本研究基于TCGA數據庫分析LINC02178在膀胱癌組織中的表達,發現LINC02178在膀胱癌組織中表達上調,與臨床病理分期有關,生存分析也發現LINC02178高表達的患者生存預后更差。上述研究表明LINC02178在癌癥的診斷和預后中有重要價值,但LINC02178在癌癥中的作用仍缺乏相關實驗研究。

本研究在生物信息學分析的基礎上,采用qRT-PCR檢測LINC02178在膀胱癌細胞中的表達水平,發現LINC02178在膀胱癌細胞T24、J82、5637中的表達量均顯著高于膀胱正常上皮細胞; 同時,轉染下調J82細胞中LINC02178的表達后, qRT-PCR檢測結果顯示si-LINC02178組細胞中LINC02178表達量顯著低于si-NC組,說明轉染干擾細胞后LINC02178表達被有效抑制; MTT細胞增殖試驗顯示, si-LINC02178組細胞在48、72 h的細胞活性顯著低于si-NC組,說明沉默膀胱癌細胞LINC02178后可降低細胞增殖活性,提示LINC02178可能參與了膀胱癌細胞的增殖過程; Transwell檢測顯示, si-LINC02178組侵襲和遷移細胞數均顯著低于si-NC組,說明沉默膀胱癌細胞LINC02178可抑制細胞的侵襲、遷移。PI3K/Akt是人體內重要的信號通路,與多種癌癥的發生發展密切相關,涉及細胞增殖、分化、侵襲等多個調控環節。CHEN Y等[20]報道環狀RNA_0000326可以通過海綿化miR-338-3p上調ETS1, 激活PI3K/Akt通路而促進膀胱癌細胞增殖和遷移。本研究發現下調LINC02178表達后, PI3K、Akt蛋白表達水平無明顯改變,而p-PI3K、p-Akt表達顯著下調,提示下調LINC02178可能通過抑制PI3K/Akt通路磷酸化來調控膀胱癌細胞的增殖和遷移。

綜上所述, LINC02178在膀胱癌組織中高表達,與患者預后不良有關,沉默LINC02178后可抑制細胞增殖、侵襲和遷移,其機制可能是通過PI3K/Akt通路發揮作用。